Recapitulating monocyte extravasation in a microfluidic organotypic model of the osteoarthritic joint

Introduction Osteoarthritis (OA) is a degenerative joint disease and the most common form of arthritis. It is characterized by joint pain during movements, stiffness, loss of flexibility and swelling, and it is one of the most debilitating disease [1]. For a long time, OA has been considered as a simple wear and tear disease involving mainly the degeneration of the cartilage, with a collateral impact on the surrounding tissues. However, recent studies suggested to consider OA as a whole-joint disease, since all joint tissues contribute to disease progression [2]. Even though the sequential events leading to OA pathogenesis are still unknown, the inflammation of the synovial tissue is considered as one of the major components that drive the progression of this disease [3]. Inflammation involves the microvasculature of the synovial membrane and is characterized by an abnormal monocyte extravasation from post-capillary venules into the surrounding tissue. Extravasation is a highly regulated process that actively involves both leukocytes and endothelial cells and is mediated by adhesion molecules, such as ICAM-1 and VCAM-1 [4]. Monocyte extravasation involves a series of sequential steps, which are tethering, rolling, adhesion and trans-endothelial migration (TEM). Once monocytes extravasate, they migrate through the extracellular matrix (ECM) towards a concentration gradient of inflammatory molecules accumulated in the synovial tissue [5]. After synovial membrane invasion, monocytes differentiate in macrophages and produce pro-inflammatory cytokines, such as Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) and Interleukin-1β (IL-1β). These pro-inflammatory cytokines act on chondrocytes by stimulating the production of matrix metalloproteinases (MMP) and inhibiting the synthesis of new ECM, finally leading to the cartilage destruction. Moreover, cytokines stimulate synovial fibroblasts to produce chemokines involved in the recruitment of monocytes, further contributing to monocyte accumulation in the synovial tissue and thus causing a chronic inflammation [3]. Treatments able to inhibit joint deterioration in OA patients are currently missing and available drugs are directed only to alleviate pain and symptoms without counteracting OA progression. To fill this gap, in the recent years, novel chemical agents have been developed. Disease-modifying osteoarthritis drugs (DMOADs) aim to decrease cartilage degradation and inflammatory cytokine release, thus inhibiting OA progression and improving tissue function [6]. However, clinical trials testing anti-cytokine drugs so far showed no significant efficacy [7]. In this scenario, drugs targeting chemokine signaling involved in the recruitment of monocytes may represent a novel strategy to prevent the accumulation of these immune cells in synovial membrane, thus limiting the progression of inflammation during OA. As a first step towards the development of effective therapeutic strategies, a deep knowledge of the pathogenic mechanisms and of the involved factors is essential. In order to have an insight in the basic process of OA inflammation, it is necessary to understand and dissect the process of monocyte extravasation towards the synovial membrane. Several in vitro models have been developed to study cell migration and extravasation, including the Boyden chamber. However, these models have major limitations, such as the gravity influence on cell migration, which does not allow understanding which factors impacted more on the extravasation, and the inability to perform the assay under conditions of physiological fluid flow and shear stress, which are fundamental for the expression of adhesion molecules involved in the extravasation process [8]. Microfluidics has recently emerged in biological research presenting many advantages compared to traditional systems, such as the reduction of sample volumes, precise temporal and spatial control of the biochemical environment, and the possibility to co-culture different types of cells in the same device, allowing to mimic tissues or organs in a single device, and producing the so called organs-on-chips [9]. Considering all these advantages, in this project we used a microfluidic device to mimic monocytes extravasation in the OA joint. The device is a multi-channel chip that resembles the synovial membrane with a post-capillary venule, the articular cartilage and the joint cavity filled with synovial fluid. In particular, we used synovial fibroblasts (SFb) and articular chondrocytes (ACh) embedded in a fibrin hydrogel to resemble synovial membrane and articular cartilage, respectively, and endothelial cells to mimic a post-capillary venule. In order to select the best pre-conditioning treatment, we firstly verified the expression of adhesion molecules directly involved in the extravasation process. In particular, we analyzed the expression of ICAM-1 and VCAM-1 in endothelial cells maintained in static conditions or subjected to different shear stress and in response to an inflammation stimulus. Then, we validated the model by assessing monocyte extravasation in response to a chemokine mix or to control medium. Afterwards, we evaluated the chemoattractant effect of OA synovial fluid on monocyte extravasation. Moreover, we examined whether the presence of tissue-specific cells (SFb and ACh) could influence monocyte extravasation, comparing the extravasation in the complete system and in the system without tissue-specific cells. Considering monocyte extravasation as a possible target for future therapies, we hypothesize to use the same microfluidic model to study the effect of antagonists for chemokine receptors on monocytes. Since endothelial cells are sensible to culture conditions, the last part of the thesis was focused on a preliminary investigation on the cytotoxicity of antagonists for CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, and Cencriviroc (CVC), a molecule targeting both CCR2 and CCR5. Material and methods To perform the experiments of this project, synovial fibroblasts (SFb) and articular chondrocytes (ACh), were obtained from OA patients, embedded in fibrin hydrogels and injected in the respective channels in the microfluidic device. To simulate a synovial post-capillary venule, we used Human Umbilical Vein Endothelial Cells-Green Fluorescent Protein (HUVEC-GFP) to generate an endothelial monolayer on the walls of the channel included in the synovial membrane compartment. In order to mimic the physiological conditions and the inflammation state occurring in vivo, HUVECs seeded in the device were subjected to a pre-conditioning treatment. To select the optimal parameters, we performed immunofluorescent assays to detect ICAM-1 and VCAM-1 expression in endothelial cells maintained in static or exposed to different flow rates (5 µL/h, 10 µL/h, 15 µL/h and 30 µL/h) combined or not with TNF-α. Once established the best pre-conditioning parameters, we validated the developed model quantifying the extravasation of primary human monocytes in response to a known chemokine mix composed of MIP-1α, MCP-1, RANTES and MIP-1β. After preconditioning the endothelial monolayer, monocytes isolated from human blood samples of healthy donors and stained with VybrantTM cell-labeling solution DiD, were injected in the endothelialized channel and their extravasation was detected. Afterwards, extravasation experiments were conducted to investigate the chemoattractant effect of synovial fluid on monocyte extravasation and whether the presence of tissue-specific cells (SFb and ACh) could influence this process. Therefore, we prepared chips injected with empty or cell-laden hydrogels. To visualize cells during the assay, we stained SFb and ACh with Vybrant™ DiI and Vybrant™ DiO cell-labeling solution, respectively. The last part of the thesis was focused on the analysis of the cytotoxicity exerted on HUVECs by the antagonists for CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5. In addition, we also evaluated the cytotoxicity of CVC, which inhibits both CCR2 and CCR5, and of all the antagonists combined together (excluding CVC). In these experiments, HUVECs were cultured in standard multi-well using the same culture protocols applied in the microfluidic chip. To evaluate whether antagonist toxicity could have a synergic effect with TNF-α, we established treatment with antagonists alone or after TNF-α exposure. Results and discussion The results of the immunofluorescence assay showed that the expression of ICAM-1 was stimulated as the shear stress increased compared to the static control. Conversely, endothelial cells in static condition did not express this adhesion molecule. On the other hand, VCAM-1 was expressed at very low levels and appeared to decrease with increasing the flow rate compared to static control. To test the influence of pro-inflammatory stimulation, we assessed the expression of ICAM-1 and VCAM-1 in endothelial cells maintained in static or subjected to flow rate at 30 µL/h, both in the presence and in the absence of TNF-α. The results evidenced that the expression of these adhesion molecules was upregulated upon TNF-α exposure compared to the condition without TNF-α. In particular, TNF-α stimulated the expression of ICAM-1 more in dynamic (30 µL/h) than in static condition, suggesting a synergic effect of flow and TNF-α. On the other hand, VCAM-1 was upregulated in the presence of TNF-α more in static condition than in samples subjected to dynamic condition, confirming the trend observed with fluid flow only. Given these results, we selected the dynamic condition that induced the highest expression of the two adhesion molecules. Therefore, for the subsequent experiments, the endothelial monolayer was pre-conditioned with fluid flow at 30 µL/h and TNF-α. The model validation experiments showed that the extravasation of monocytes was directional toward the chemokine channel, confirming that the observed extravasation was specific and driven by chemokine signaling. As we expected, monocyte extravasation in the presence of control medium was almost absent. Conversely, a high number of monocytes extravasated in response to the chemokine mix. Moreover, we verified that after endothelial pre-conditioning the number of extravasated cells was higher than in static chips, suggesting that the pre-conditioning simulated better the in vivo conditions. Subsequent extravasation assays showed that monocytes extravasated in the presence of OA synovial fluid, while in the presence of control medium they remained confined inside the endothelial channel, thus demonstrating the chemoattractant effect of OA synovial fluid. The directional extravasation towards the lower compartment induced by synovial fluid was significantly higher compared to the non-specific extravasation towards the upper compartment in all the tested conditions. Surprisingly, a higher number of monocytes extravasated in the system without supporting cells (SFb and ACh) compared to the extravasation observed in the complete system. These results indicated that SFb and ACh do play a role in the extravasation process, making the complete system more similar to the in vivo condition than a simplified system. Concerning the results of cytotoxicity assays, it emerged that all the antagonists had some cytotoxic effect on HUVECs, which decreased at low antagonist concentrations. Unexpectedly, all the antagonists combined together had a lower cytotoxic effect compared to the single antagonists. Also CVC cytotoxicity appeared to be lower than that of single antagonists, making it a promising antagonist to be tested in our device. HUVECs treated also with TNF-α showed overall a lower cytotoxicity in response to single or combined antagonists compared to HUVECs not exposed to TNF-α. These preliminary data will be used in future to optimize the experimental conditions to test the antagonist and evaluate their ability to inhibit monocyte extravasation in our microfluidic model. Conclusions and future perspectives In this thesis, we validated a microfluidic organotypic device that models the process of monocyte extravasation to the osteoarthritic joint. We optimized the pre-conditioning parameters and assessed monocyte extravasation in response to a mix of known chemoattractant molecules or to patient-derived synovial fluids. In the next future, the results obtained in the cytotoxicity assay will be applied to use the chip as a platform to screen anti-chemokine drugs.

Introduzione L'osteoartrosi (OA) è una malattia articolare degenerativa ed è la forma più comune di artrosi. Questa patologia provoca dolori articolari durante i movimenti, rigidità, perdita di flessibilità e gonfiore ed è una delle malattie più debilitanti [1]. Per molto tempo l'OA è stata considerata una semplice malattia da usura, che coinvolgeva principalmente la degenerazione della cartilagine con un impatto collaterale sui tessuti circostanti. Tuttavia, recenti studi hanno suggerito di considerare l'OA come una malattia dell'intera articolazione poiché tutti i tessuti articolari contribuiscono alla progressione della malattia [2]. Anche se gli eventi sequenziali che portano alla patogenesi dell'OA sono ancora sconosciuti, l'infiammazione del tessuto sinoviale è considerata uno dei principali componenti che guidano la progressione di questa malattia [3]. L'infiammazione coinvolge la microvascolatura della membrana sinoviale ed è caratterizzata da un livello anomalo dell’extravasazione dei monociti dalle venule post-capillari verso i tessuti circostanti. L’extravasazione è un processo altamente regolato che coinvolge attivamente sia i leucociti che le cellule endoteliali ed è mediata dalle molecole di adesione, come ICAM-1 e VCAM-1 [4]. L’extravasazione dei monociti comporta una serie di passaggi sequenziali, che sono “tethering”, rotolamento, adesione e migrazione transendoteliale. Una volta extravasati, i monociti migrano attraverso la matrice extracellulare (ECM) verso un gradiente di concentrazione di molecole chemoattraenti accumulate nel tessuto sinoviale [5]. Dopo l’invasione della membrana sinoviale, i monociti differenziano in macrofagi e producono diverse citochine pro-infiammatorie, come il fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) e l'interleuchina-1β (IL-1β). Queste citochine pro-infiammatorie agiscono sui condrociti stimolando la produzione di metallo-proteinasi della matrice (MMP) e inibendo la sintesi di nuova ECM, portando, infine, alla distruzione della cartilagine. Le citochine, inoltre, stimolano i fibroblasti sinoviali a produrre chemochine coinvolte nel reclutamento dei monociti, contribuendo ulteriormente all’accumulo di monociti nel tessuto sinoviale, causando quindi un'infiammazione cronica [3]. Attualmente mancano trattamenti in grado di inibire il deterioramento dell’articolazione nei pazienti con OA e i farmaci disponibili sono diretti solo ad alleviare il dolore e i sintomi senza contrastare la progressione dell'OA. Per colmare questa lacuna, negli ultimi anni sono stati sviluppati nuovi agenti chimici. I “Disease-modifying osteoarthritis drugs” (DMOAD) mirano a ridurre la degradazione della cartilagine e il rilascio di citochine infiammatorie, inibendo così la progressione dell'OA e migliorando la funzione dei tessuti [6]. Tuttavia, gli studi clinici che hanno testato i farmaci anti-citochine non hanno mostrato un'efficienza significativa finora [7]. In questo scenario, farmaci che interagiscono con le chemochine coinvolte nel reclutamento dei monociti, possono rappresentare una nuova strategia per prevenire per l’accumulo di queste cellule immunitarie nella membrana sinoviale, limitando così la progressione dell'infiammazione durante l'OA. Il primo passo essenziale verso lo sviluppo di strategie terapeutiche efficaci è una profonda conoscenza dei meccanismi patogenetici e dei fattori coinvolti. Al fine di avere una visione del processo alla base dell'infiammazione durante l'OA, è necessario comprendere e analizzare il processo di extravasazione dei monociti verso la membrana sinoviale. Diversi modelli in vitro sono stati sviluppati per studiare la migrazione e l’extravasazione delle cellule, come la camera di Boyden. Tuttavia, questi modelli presentano grandi limitazioni come, per esempio, l’influenza della gravità sulla migrazione delle cellule, che non permette di capire quali fattori abbiano avuto un impatto maggiore sull’extravasazione, e l’impossibilità di effettuare saggi in condizioni fisiologiche di flusso e forze di taglio, fondamentali per l'espressione delle molecole di adesione coinvolte nel processo di extravasazione [8]. La microfluidica è recentemente emersa nella ricerca biologica presentando numerosi vantaggi rispetto ai sistemi tradizionali, come la riduzione dei volumi dei campioni, un preciso controllo temporale e spaziale dell'ambiente biochimico e la possibilità di co-coltivare diversi tipi di cellule nello stesso dispositivo, permettendo di simulare tessuti o organi in un unico dispositivo, producendo i cosiddetti “organ-on-chip” [9]. Considerando tutti questi vantaggi, in questo progetto abbiamo utilizzato un dispositivo microfluidico in grado di simulare l’extravasazione dei monociti in un'articolazione affetta da OA. Il dispositivo è un chip multicanale che imita la membrana sinoviale con una venula post-capillare, la cartilagine articolare e la cavità articolare riempita con liquido sinoviale. In particolare, abbiamo usato fibroblasti sinoviali (SFb) e condrociti articolari (ACh) incorporati in gel di fibrina per mimare rispettivamente la membrana sinoviale e la cartilagine articolare, e le cellule endoteliali per mimare una venula post-capillare. Per selezionare il miglior pre-trattamento, abbiamo prima verificato l’espressione di molecole di adesione direttamente coinvolte nel processo di extravasazione. In particolare, abbiamo analizzato l’espressione di ICAM-1 e VCAM-1 nelle cellule endoteliali mantenute in condizioni statiche o soggette a differenti sforzi di taglio e in risposta a uno stimolo infiammatorio. Successivamente abbiamo validato il modello valutando l’extravasazione dei monociti in risposta a una mix di chemochine o a un terreno di controllo. Dopodiché, abbiamo valutato l'effetto chemoattraente del liquido sinoviale derivato da pazienti con OA sull’extravasazione dei monociti. Inoltre, abbiamo valutato se la presenza delle cellule tessuto-specifiche (SFb e ACh) possa influenzare l’extravasazione dei monociti, confrontando l’extravasazione nel sistema completo e nel sistema senza cellule tessuto-specifiche. Considerando l’extravasazione dei monociti come possibile obiettivo per future terapie, ipotizziamo di utilizzare lo stesso modello microfluidico per studiare l'effetto degli antagonisti dei recettori delle chemochine sui monociti. Poiché le cellule endoteliali sono sensibili alle condizioni di coltura, l'ultima parte della tesi si è focalizzata sull’indagine preliminare della citotossicità degli antagonisti per CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5 and Cencriviroc (CVC), una molecola che interagisce sia con CCR2 e con CCR5. Materiali e metodi Per eseguire gli esperimenti di questo progetto, fibroblasti sinoviali (SFb) e condrociti articolari (ACh), sono stati ottenuti da pazienti affetti da OA, incorporati in gel di fibrina e iniettati nei rispettivi canali nel dispositivo microfluidico. Per simulare una venula post-capillare sinoviale, abbiamo utilizzato “Human Umbilical Vein Endothelial cells-Green Fluorescent Protein” (HUVEC-GFP) per generare un monostrato di endotelio sulle pareti del canale incluso nel compartimento della membrana sinoviale. Al fine di imitare le condizioni fisiologiche e lo stato di infiammazione che si verificano in vivo, le HUVEC seminate nel dispositivo sono state sottoposte a un trattamento di pre-condizionamento. Per selezionare i parametri ottimali abbiamo eseguito saggi di immunofluorescenza per individuare l'espressione di ICAM-1 e VCAM-1 nelle cellule endoteliali mantenute in statico o sottoposte a diverse portate (5 µL/h, 10 µL/h, 15 µL/h and 30 µL/h) combinate o meno con TNF-α. Una volta stabiliti i migliori parametri di pre-condizionamento, abbiamo validato il modello sviluppato, quantificando l’extravasazione di monociti umani primari in risposta a un mix di chemochine noto composto da MIP-1α, MCP-1, RANTES e MIP-1β. Dopo aver pre-condizionato il monostrato endoteliale, i monociti, isolati da campioni di sangue umano di donatori sani e colorati con VybrantTM cell-labeling solution DiD, sono stati iniettati nel canale endotelializzato e la loro extravasazione è stata rilevata. Successivamente, sono stati condotti esperimenti di extravasazione per studiare l'effetto chemoattraente del liquido sinoviale sull’extravasazione dei monociti e se la presenza delle cellule tessuto-specifiche (SFb e ACh) possa influenzare questo processo. Pertanto, abbiamo preparato chip iniettati con gel vuoti o carichi di cellule. Per visualizzare le cellule durante il test, abbiamo colorato SFb e ACh con Vybrant™ DiI and Vybrant™ DiO cell-labeling solution, rispettivamente. L'ultima parte della tesi è stata focalizzata sull'analisi della citotossicità esercitata sulle HUVEC dagli antagonisti per CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5. Inoltre, abbiamo valutato anche la citotossicità di CVC, che inibisce sia CCR2 che CCR5, e di tutti gli antagonisti combinati tra loro (escluso CVC). In questi esperimenti, le HUVEC sono state coltivate in piastre multi-well standard utilizzando gli stessi protocolli di coltura applicati nel chip microfluidico. Per valutare se la tossicità degli antagonisti potesse avere un effetto sinergico con il TNF-α, abbiamo effettuato un trattamento con gli antagonisti da soli o dopo esposizione al TNF-α. Risultati e discussione I risultati del saggio di immunofluorescenza hanno mostrato che l'espressione di ICAM-1 era stimolata all'aumentare dello shear stress rispetto al controllo statico. Al contrario, le cellule endoteliali in condizioni statiche non esprimevano questa molecola di adesione. D'altra parte, VCAM-1 era espressa a livelli molto bassi e sembrava che l'espressione diminuisse con l'aumentare della portata rispetto al controllo statico. Per testare l'influenza della stimolazione pro-infiammatoria, abbiamo valutato l’espressione di ICAM-1 e VCAM-1 nelle cellule endoteliali mantenute in condizioni statiche o soggette a portata di 30 µL/h, entrambe in presenza o in assenza di TNF-α. I risultati hanno evidenziato che l'espressione di queste molecole di adesione era sovraregolata dopo l’esposizione al TNF-α rispetto alla condizione senza TNF-α. In particolare, il TNF-α ha stimolato l'espressione di ICAM-1 più in dinamico (30 µL/h) che in condizioni statiche, suggerendo un effetto sinergico tra flusso e TNF-α. D'altra parte, VCAM-1 era sovraregolato in presenza di TNF-α più nella condizione statica che nei campioni sottoposti a condizioni dinamiche, confermando la tendenza osservata solo con il flusso. Alla luce di questi risultati, abbiamo selezionato la condizione dinamica che ha indotto la maggior espressione delle due molecole di adesione. Pertanto, per gli esperimenti successivi, il monostrato endoteliale è stato pre-condizionato con flusso di fluido a 30 µL / he TNF-α. Gli esperimenti per la validazione del modello hanno mostrato che l’extravasazione dei monociti era direzionale verso il canale delle chemochine, confermando che l’extravasazione osservata era specifica e guidata dal segnale delle chemochine. Come atteso, l’extravasazione dei monociti in presenza del mezzo di controllo era praticamente assente. Al contrario, un numero elevato di monociti è extravasato in risposta alla mix di chemochine. Inoltre, abbiamo verificato che dopo il pre-condizionamento dell’endotelio il numero di cellule extravasate era più alto rispetto ai chip statici, suggerendo che il pre-condizionamento simulasse meglio le condizioni in vivo. I saggi di extravasazione successivi hanno mostrato che i monociti sono extravasati in presenza di liquido sinoviale di pazienti con OA, mentre in presenza del mezzo di controllo sono rimasti confinati all'interno del canale endoteliale, dimostrando l'effetto chemoattraente del liquido sinoviale. L’extravasazione direzionale verso il compartimento inferiore indotto dal liquido sinoviale era significativamente maggiore rispetto a quella non specifica verso il compartimento superiore in tutte le condizioni testate. Sorprendentemente, i monociti sono extravasati in maggior numero nel sistema senza le cellule di supporto (SFb e ACh) rispetto all’extravasazione osservata nel sistema completo. Questi risultati hanno indicato che SFb e ACh hanno un ruolo nel processo di extravasazione, rendendo il sistema completo più simile alle condizioni in vivo rispetto a un sistema semplificato. Per quanto riguarda i risultati dei test di citotossicità, è emerso che tutti gli antagonisti hanno avuto un effetto citotossico sulle HUVEC, che è diminuito a concentrazioni di antagonista più basse. Inaspettatamente tutti gli antagonisti combinati insieme, hanno avuto un effetto citotossico inferiore rispetto ai singoli antagonisti. Anche la citotossicità di CVC sembrava inferiore rispetto ai singoli antagonisti, rendendolo un antagonista promettente da utilizzare nel nostro dispositivo. Le HUVEC trattate anche con TNF-α hanno mostrato complessivamente una minore citotossicità in risposta al singolo antagonista o agli antagonisti combinati tutti insieme comparate alle HUVEC non esposte al TNF-α. Questi dati preliminari verranno utilizzati in futuro per ottimizzare le condizioni sperimentali per testare gli antagonisti e valutare la loro abilità per inibire l’extravasazione dei monociti nel nostro modello microfluidico. Conclusioni e prospettive future In questa tesi, abbiamo convalidato un dispositivo organotipico microfluidico che modella il processo di extravasazione dei monociti in un’articolazione affetta da OA. Abbiamo ottimizzato i parametri di pre-condizionamento e valutato l’extravasasazione dei monociti in risposta a un mix di molecole chemoattrattive note o al liquido sinoviale derivato da pazienti. Nel prossimo futuro, i risultati ottenuti nei test di citotossicità verranno applicati per usare il chip come piattaforma per la selezione di farmaci anti-chemochine.