Study of cell photodamage induced by femtosecond laser pulse irradiation

The advent of nonlinear optics and its application in microscopy has opened new perspectives in the fields of biology, medicine, chemistry and physics. Nonlinear optical microscopy (NLOM) techniques have shown particular promise in medical and biological applications, because they enable researchers to obtain different types of information from biological samples. To achieve the high signal-to noise ratio (SNR) required for high-speed and high-resolution imaging, it is usually necessary to increase the power of the pumping laser. A lot of the potential of these techniques lies in the possibility of in-vivo applications, but to follow this road it's imperative to develop a comprehensive understanding of the possible negative effects that laser exposure, especially at the high intensities required for nonlinear applications, can have on biological samples. These effects were often neglected in the past because they weren't as relevant in traditional microscopy techniques, which often employed lower intensities and longer laser pulses. However, they are certainly relevant now. The aim of this research thesis is to present our findings on the damage of HeLa cells induced by the exposure - either scanned or fixed - to femtosecond laser pulses. Two types of cell damage were studied: cell death, both immediate and delayed, and impaired cell reproduction. There are different mechanisms through which cell photodamage can occur; we reserved particular attention to the topic of photothermal damage. This thesis project is part of the work of the VIBRA research group, which aims to to develop broadband high-speed Coherent Raman Scattering (CR) techniques.

L'avvento dell'ottica non lineare e le sue applicazioni nella microscopia hanno aperto nuove prospettive nei campi della biologia, medicina, chimica e fisica. Le tecniche di Nonlinear Optical Microscopy (NLOM) hanno mostrato particolare promessa nelle applicazioni biologiche e mediche, poichè consentono ai ricercatori di ottenere diversi tipi di informazione da campioni biologici. Per ottenere un rapporto segnale-rumore (SNR) alto, che è necessario per ottenere immagini ad alta risoluzione e velocemente, è in genere necessario aumentare la potenza del laser di pompa. Queste tecniche forniscono grandi possibilità per le applicazioni in-vivo, ma per poter fare progressi in questa direzione è imperativo arrivare a comprendere a fondo i possibili effetti negativi che l'esposizione a un laser a impulsi, specialmente alle alte intensità richieste dalle applicazioni non lineari, può avere sul materiale biologico. Questi effetti sono stati relativamente trascurati in passato perchè erano di minore rilevanza nelle applicazioni di microscopia tradizionale, in cui venivano usate intensità più basse e impulsi più lunghi. Lo scopo di questa tesi di ricerca è presentare i risultati del nostro studio sul danneggiamento di cellule HeLa indotto dall'esposizione ad impulsi laser a femtosecondi. Abbiamo studiato due tipi di danneggiamento: la morte cellulare, sia immediata che ritardata, e l'alterazione del ciclo riproduttivo. Esistono diversi meccanismi attraverso i quali il fotodanneggiamento cellulare può essere inflitto; noi abbiamo riservato particolare attenzione al danneggiamento fototermico. Questo progetto di tesi fa parte del lavoro del gruppo di ricerca VIBRA, che mira a sviluppare tecniche broadband ad alta velocità di Raman Scattering Coerente.