A multimodal nonlinear optical microscope for biological applications

The need for better diagnostic tools has triggered a renaissance in optical microscopy instrumentation development. Conventional light microscopes, based on linear techniques, have a series of drawbacks: high energy and low penetration depth of UV and VIS light used and low resolution imaging due to the linear processes involved. These limitations can be overcome building imaging systems based on nonlinear optical processes, that employ light in the NIR spectral range. This thesis work aims at introducing a home-made Multimodal Nonlinear Optical Microscope, which allows one to perform Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) microscopy and Two-Photon Excitation Fluorescence (TPEF) microscopy. Given the final goal of employing this setup in the field of biological investigation, a very important requirement is to be able to visualize large sample areas. In the previous version of the presented system, a laser-scanning based imaging modality was available, with a Field Of View (250x250 μm2) limited essentially by the Objective. For this reason, in this thesis work particular attention is given to the implementation of the hardware, i.e. a XY motorized sample stage, and to the development of the software in order to perform also sample-scanning imaging modality. Moreover, the latter enables to test quickly the real imaging capability of the new kind of phenomenon exploited. Indeed, in the laser-scanning based imaging modality, which employs galvanometric mirrors, a perfect alignment of all the optics over all the possible beam position is required to avoid vignetting. Instead, with a XY motorized sample stage the optical system needs to be aligned only to a fixed laser beam position. Experimental results on test samples (Poly-methyl methacrylate, Polystyrene and fluorescent beads) and biological samples, obtained with sample-scanning based imaging, will be then presented, showing the huge potential of this kind of system.

La necessità di strumenti diagnostici sempre più affidabili e efficienti ha innescato una rinascita nello sviluppo della strumentazione per microscopia ottica. I microscopi convenzionali, basati su tecniche ottiche lineari, presentano una serie disvantaggi: alta energia e bassa profondità di penetrazione della luce UV e VIS utilizzate e imaging a bassa risoluzione a causa dei processi lineari coinvolti. Queste limitazioni possono essere superate con sistemi di imaging basati su processi ottici non lineari, che impiegano la luce nella gamma spettrale NIR. Questo lavoro di tesi mira a introdurre un microscopio ottico home-made, multimodale e non lineare, che consente di eseguire microscopia a dispersione Raman anti-Stokes Coerente e microscopia a fluorescenza da eccitazione a due fotoni. Dato l'obiettivo finale di impiegare questo strumento nel campo dell'indagine biologica, un requisito necessario è quello di essere in grado di visualizzare ampie aree di campione. Nella versione precedente del sistema presentato, era disponibile la sola modalità di imaging basata sulla scansione laser, la quale è caratterizzata da campo visivo (250x250 μm2) limitato essenzialmente dall'obiettivo. Per questo motivo, durante questo lavoro di tesi, si è prestata particolare attenzione all'implementazione dell'hardware, ovvero del supporto motorizzato XY su cui viene disposto il campione, e allo sviluppo del relativo software al fine di aver a disposizione anche una modalità di imaging a laser fisso. Inoltre, quest'ultima modalità consente di testare rapidamente la reale capacità di imaging di nuove tipologie di fenomeno sfruttate. Infatti, nella modalità di imaging basata sulla scansione laser, che impiega specchi galvanometrici, è necessario un perfetto allineamento di tutte le ottiche su tutte le possibili posizioni del fascio per evitare la vignettatura. Invece, grazie alla nuova modalità implementata, il sistema ottico richiede di essere allineato solo ad una posizione fissa del fascio laser. Saranno quindi presentati risultati sperimentali su campioni di prova (poli-metilmetacrilato, polistirene e sfere fluorescenti) e campioni biologici, che mostrano l'enorme potenziale di questo tipo di sistema.