Design and preparation of complex nanostructures aimed at biomedical applications

The purpose of this research is to obtain a composite nanoscale biomaterial based on assembling iron oxide nanoparticles with glycosaminoglycans (GAGs: Hyaluronic acid or Heparin derivatives), capable to combine anticancer therapeutic and diagnostic imaging aid functions. Super Paramagnetic Iron Oxide Nanoparticles (Fe3O4, SPIONs) were selected due to their capability to act as MRI negative contrast agents. At first, GAGs and bovine serum albumin (BSA) have been covalently conjugated to dopamine (DA), thus enabling their further anchoring to the SPIONs previously prepared by co-precipitation method. HA and Heparin derivatives (Low Molecular Weight and glycol-split Heparins) were chosen as selective targeting or therapeutic moieties, potentially able to direct the nanosystem to overexpressed proteins (e.g. CD44 receptors, Heparanase enzyme) or to interact with pathways typical of tumoral environment. On the other hand, BSA was found to simultaneously serve as stabilizing component and to ease an efficient entrapping and release of the hydrophobic cytotoxic drug paclitaxel (PTX). Hyaluronic Acid (HA) based SPIONs (Fe3O4@BSA/HA) appear as nanosystems of 70–90 nm size containing different iron cores of 5 nm, quite homogenous and capable to afford well-dispersed and stable colloid. They show a good potential in terms of PTX loading, additionally improving its water solubility by at least four orders of magnitude. Furthermore, TD-NMR experiments highlight their very good capacity to interfere with relaxation times of surrounding water protons (a prerequisite for the applicability of SPIONs as negative contrast agents). The functionalization of SPIONs with Heparin derivatives (SPIONs@BSA/LMWH and SPIONs@BSA/gs-Hep) gives results consistent with the already cited HA-SPIONs, with an accentuated potential effectiveness as negative MRI contrast agents given by r2/r1 ratios competitive with those of SPIONs already in the market. Unfortunately, some cytotoxicity problems were encountered. The first attempt to solve them passes through an innovative formulation strategy which takes advantage of the encapsulation of Heparin-based SPIONs within self-assembled lipid nanoparticles (SALNs), generally considered biocompatible. To date, it was successfully showed that SALNs are efficient carriers for SPIONs functionalized with electrostatically linked Heparin (SALNs-SPIONs@HEPA), which are also able to reduce their cytotoxicity to CaCo-2 cells and to overcome the loss of Heparin coating in biological fluids. Moreover, SALNs-SPIONs@HEPA are efficiently internalized in CaCo-2 cells, a cell line model used as an indirect indication of intestinal lymphatic absorption, thus being elected as promising tool for delivering the theranistic SPIONs@HEPA to lymphatic circulation by the oral route.

La progettazione, la preparazione e la caratterizzazione di nanoparticelle di ossido di ferro funzionalizzate con biopolimeri sono l’oggetto di questo lavoro di tesi. I glicosaminoglicani (GAG), tra cui l’acido ialuronico (HA) e specifici derivati dell’eparina(eparina a basso peso molecolare, LMWH, ed eparina con parte degli acidi uronici costituenti splittati, gs-Hep), sono stati selezionati per riuscire a combinare in un unico nanosistema funzioni terapeutiche e diagnostiche a carico di forme tumorali. E’ infatti ben noto che le nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche (Fe3O4, SPIONs) possano essere utilizzate come agenti di contrasto nell’imaging a risonanza magnetica (MRI). I citati glicosaminoglicani sono stati selezionati quali possibili promotori di una targeting attivo verso proteine sovraespresse in diversi tipi di cellule tumorali (ad esempio, i recettori CD44 o l’enzima eparanasi) e/o il quanto diretti inibitori di segnali e meccanismi pro-angiogenici e metastatici. Inoltre, il coating delle SPIONs non si compone solo dei GAG citati ma include la sieroalbumina bovina (BSA), una proteina stabilizzante il nanosistema stesso ed in grado di fornire tasche idrofobiche per l’inclusione e il rilascio di farmaci antitumorali poco biodisponibili, tra cui il Paclitaxel (PTX). Da un punto di vista formulativo, GAG e BSA sono stati entrambi funzionalizzati con una molecola spacer, la dopamina (DA), in grado di garantire il successivo legame ai cores di ossido di ferro. Le SPIONs a base di acido ialuronico (Fe3O4@BSA/HA) si presentano come nanosistemi con dimensioni globali di 70-90 nm, con una struttura “a melograno”: diversi nuclei inorganici di circa 5 nm sono inclusi nel coating organico, e appaiono come dispersioni colloidali stabili e omogenee. Esse hanno un buon potenziale in termini di loading dell’antimitotico PTX e ne migliorano la solubilità in ambiente acquoso di almeno quattro ordini di grandezza. Inoltre, gli esperimenti di TD-NMR (Time Domain Nuclear Magnetic Resonance) evidenziano la loro ottima capacità di interferire con i tempi di rilassamento dei protoni dell’acqua circostanti (prerequisito fondamentale in vista della loro applicabilità quali agenti di contrasto MRI). La funzionalizzazione delle SPIONs con i derivati eparinici (SPIONs@BSA/LMWH and SPIONs@BSA/gs-Hep) ha fornito risultati coerenti con quelli di Fe3O4@BSA/HA, in termini di stabilità, struttura e morfologia. E’ stata osservata un’accentuata potenziale efficacia come agenti di contrasto MRI negativi, dati i rapporti r2/r1 competitivi con quelli di SPION già presenti sul mercato. Infine, l’inclusione di SPIONs a base di eparina all’interno di nanoparticelle lipidiche autoassemblate (SALNs) si propone come possibile strategia risolutiva circa i problemi di citotossicità purtroppo riscontrati con le SPIONs con i derivati eparinici. Ad oggi, è stato dimostrato con successo che le SALNs inglobano efficacemente SPIONs con coating di eparina legata elettrostaticamente ai cores di Fe3O4 (SALNs-SPIONs @ HEPA) e che questa strategia consente di ridurre la loro citotossicità nei confronti delle cellule CaCo-2 e di risolvere il problema della perdita del rivestimento eparinico nei fluidi biologici. Inoltre, le SALNs-SPIONs @ HEPA vengono efficacemente internalizzate nelle cellule CaCo-2, un modello di linea cellulare usato come indiretta indicazione dell'assorbimento linfatico intestinale. Esse sono quindi da considerare come promettente strumento per la circolazione linfatica di SPIONs con i derivati eparinici mediante via orale.