Overcoming the planktonic paradigm for in vitro culture of the whole cystic fibrosis microbiota

World Health Organization (WHO) classified bacteria as one of the biggest medical concerns of the current century. This is mainly due to their ability to easily and rapidly adapt to the most adverse environmental conditions, thus making ineffective most of the treatment developed to fight their colonization. Generally, infectious bacterial diseases are not characterized by the presence of a single type of bacteria, but rather by the establishment of various species. These communities share some common features such as the organization within a polysaccharidic extracellular matrix called biofilm. Pathogens exploit biofilms to protect themselves and to enhance their communicative ability. Practically, inside the biofilm bacteria, which are generally classified as unicellular organisms, behave like pluricellular ones. As a result, the establishment of biofilms decreases the effectiveness of antimicrobial treatments, while increasing detrimental effects produced by the presence of bacteria inside the organism. Cystic fibrosis (CF) represents a glaring example of how bacteria are able to exploit a compromised clinical picture to penetrate the inner districts of the human body, and then begin to proliferate. CF is an inherited disease caused by the misfunction of cystic fibrosis transmembrane conductor regulator (CFTR) gene, resulting in the production of aberrant airway mucus. The presence of a thick and dense mucus layer leads to the impairment of the muco-ciliary clearance mechanism. In these conditions, lungs are not able to clean themselves, and pathogens trapped within the mucus are able to proliferate without being expelled. CF microbiota has been demonstrated to be characterized by the co-presence of about thirty bacterial species, although most of researches are focused on the elucidation of interactions intervening among S. aureus and P. aeruginosa. Actually, these two pathogens are considered of crucial importance for the treatment of the pathology. S. aureus is the first colonizer of CF patients’ lungs, starting from the childhood. P. aeruginosa is an aggressive pathogen which infects patients from the adolescence, and is responsible for the outburst of violent pulmonary exacerbations. The copresence of these two pathogens generates a complex network of bacterium-bacterium, and bacterium-environment interactions, which generally results in S. aureus being outcompeted by P. aeruginosa in the fight for resources. Such a pathology highlights the importance of investing resources in researches against bacterial communities. However, nowadays it still does not exist a platform allowing scientists to implement a unique co-culture protocol, resulting in the production of heterogeneous results, which are difficult to have compared each other. Moreover, most of studies carried out during the last years relied on the realization of planktonic co-cultures, thus neglecting a series of crucial mechanisms which could be reproduced only through three-dimensional co-cultures. In this thesis it has been demonstrated the possibility of implementing a novel and promising synthetic mucus model to the realization of in vitro biofilm cocultures of S. aureus and P. aeruginosa. Various scenarios were tested in order to mimic different interactions between bacteria and the surrounding environment, as well as between bacteria themselves.

L’ Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha classificato le patologie di natura batterica come uno dei maggiori problemi della nostra epoca. Questo fatto è soprattutto dovuto all’abilità di questi microorganismi di adattarsi facilmente, ed in modo estremamente rapido, a condizioni ambientali tutt’altro che ottimali, riuscendo così a rendere inefficace la maggior parte dei trattamenti messi a punto per contrastare la loro presenza. Generalmente, le condizioni patologiche di natura batterica non sono caratterizzate dalla presenza di un solo tipo di patogeni, bensì dalla contemporanea colonizzazione di più specie. Le comunità multimicrobiche condividono diversi aspetti chiave, primo tra tutti l’organizzazione all’interno di una matrice extracellulare di natura polisaccaridica, chiamata biofilm. Il biofilm viene sfruttato dai batteri per proteggersi dalle minacce esterne, e per incrementare il loro potere comunicativo. Di fatto, all’interno del biofilm, quelli che sono generalmente classificati come organismi unicellulari iniziano a comportarsi come un’entità pluricellulare. Dirette conseguenze dell’insediamento del biofilm sono quindi la riduzione dell’efficacia dei trattamenti antibiotici, e il contemporaneo aumento del deterioramento prodotto dalla presenza dei batteri sui tessuti interni dell’organismo. La fibrosi cistica rappresenta un esempio lampante di come i batteri siano in grado di sfruttare un quadro clinico compromesso, al fine di penetrare i distretti più interni del corpo umano, per poi iniziare la proliferazione. Questa patologia ereditaria è causata dal malfunzionamento del gene regolatore dei conduttori trans-membranali della fibrosi cistica, il che si traduce nella secrezione di muco aberrante nelle vie respiratorie. La presenza di questo spesso e denso strato di muco causa il malfunzionamento della clearance muco-ciliare. Di fatto, in queste condizioni i polmoni non sono in grado di auto-pulirsi, e i patogeni intrappolati nel muco sono quindi liberi di proliferare, senza il pericolo di essere espulsi. Nonostante sia stato dimostrato che il microbiota della fibrosi cistica sia caratterizzato dalla copresenza di più di trenta specie batteriche, la maggior parte delle ricerche in questo campo si è focalizzata sullo studio delle interazioni che intercorrono tra S. aureus e P. aeruginosa. Questi microorganismi sono infatti ritenuti di fondamentale importanza nel design di un trattamento per questa patologia. S. aureus è il primo colonizzatore dei polmoni dei pazienti, a cominciare dall’infanzia. P. aeruginosa è invece un batterio estremamente aggressivo, la cui comparsa è osservabile già dall’adolescenza del paziente; è ritenuto il principale responsabile per l’insorgere di frequenti e violente esacerbazioni polmonari. La copresenza di questi due microorganismi genera una complessa rete di interazioni sia tra i batteri stessi che tra i batteri e l’ambiente circostante, e generalmente culmina col successo di P. aeruginosa nel prevaricare S. aureus nella competizione per le risorse. Questa patologia evidenzia l’importanza dell’investire risorse nella ricerca contro le comunità batteriche. Sfortunatamente, al giorno d’oggi non esiste ancora uno strumento che permetta agli scienziati di applicare un protocollo univoco agli esperimenti in co-cultura; questa lacuna ha come conseguenza la produzione di risultati eterogenei, difficili da confrontare tra di loro. Inoltre, la maggior parte degli studi condotti negli ultimi anni si è fondata sulla realizzazione di co-culture planctoniche, tralasciando quindi una serie di meccanismi di vitale importanza, riproducibili esclusivamente attraverso co-culture tridimensionali. In questa tesi è stata dimostrare la possibilità di implementare un promettente modello sintetico di muco polmonare, per la realizzazione in vitro di co-culture tridimensionali di S. aureus e P. aeruginosa. Inoltre, sono stati testati svariati scenari, al fine di riprodurre vari tipi di interazione, sia tra i batteri stessi che tra i batteri e l’ambiente circostante.