Analisi sperimentale dell'influenza di diversi protocolli di terapia antitrombotica nell'attivazione piastrinica in pazienti portatori di LVAD : il ruolo della terapia antiaggregante

Background: Advanced Heart Failure (aHF) represents the advanced phase of multiple pathological conditions of the heart and coronary arteries. This condition seriously compromise cardiac function leading to an inadequate cardiac output. Currently preventive measures and medical therapies are not able to contrast and/or reduce aHF morbidity and mortality. The only therapy that can resolve this disease is heart transplant, but it is not available to all patients due to organs lack and rigid selection criteria for transplant candidates. Thanks to bioengineering’s developments over the last 50 years, the mechanical circulatory support devices (MCS devices) represent today an effective solution for the treatment of patients affected by aHF. Among these, the most suitable devices for long-term treatment are the ventricular support device (VAD), in particular continuous flow VAD for the left ventricle (cf-LVAD). State-of-the-art LVADs are miniaturized implantable electrically powered pumps, wherein a rotating (axial or centrifugal) impeller provides a propulsive energy to direct a continuous blood flow from the left ventricle apex to the aorta. In this way the device mechanically supports the pumping function of the ventricle and, in the most severe pathologies, completely replaces it. The present project has been realized in collaboration between the Biomechanics Group of the Department of Electronics, Information and Bioengineering (DEIB) of the Politecnico di Milano and Università Vita Salute San Raffaele (UniSR) in Milan. The aim of the work is to evaluate, through the execution of an experimental diagnostic test, what is the role of antithrombotic drug therapy, and in particular the contribution of Aspirin (ASA), antiplatelet drug, in limiting platelet activation in LVAD patients and therefore prevent possible thrombotic events. Indeed, although the development of LVAD technology offers a survival rate of 85% at one-year post-implant and despite the remarkable improvements in reliability, LVAD therapy is still accompanied by the development of post-implant complications, due to the complex pump-patient interaction. Thrombosis (pump thrombosis and ischemic stroke) represents the most feared post-implant complication and it is closely linked to the alteration of physiological hemodynamics caused by LVAD. In particular, the high shear stresses (100-500 Pa) generated by the high impeller rotation speeds, necessary to achieve physiological cardiac output, are the trigger of Platelet Activation (PA), leading to thrombus formation. In order to limit PA and to prevent thrombosis, LVAD recipients are regularly administrated with a combination of antiplatelet and anticoagulant drugs (usually aspirin and warfarin, respectively). The first one is an irreversible inhibitor of the cyclooxygenase enzyme, which is responsible for the production of thromboxane, a key element in platelet aggregation. The second one is a vitamin K antagonist: the vitamin K is necessary for the activation of various factors of the coagulation cascade. However, the absence of a patient-specific antithrombotic regime, combined with the negative effects induced by the LVAD (acquired von Willebrand syndrome, arteriovenous malformations and gastrointestinal mucosa membrane mutations), often leads to hemorrhagic complications. It is therefore fundamental to monitor the state of platelet activation throughout the duration of the support in order to evaluate patient-specific response to the drugs and to verify the absence of thrombosis risk for LVAD recipients. Actually, in the clinical practice, LVAD patients’ monitoring is based mainly on the International Normalized Ratio (INR) measurements, which also evaluates the effectiveness of anticoagulant drugs such as warfarin. However, there is no test or parameter used to assess the effects of ASA, which may be one of the causes of the onset of bleeding events. The aim of this study is to use the Platelet Activity State (PAS) assay as tool for developing an experimental diagnostic test for the evaluation of pro-thrombotic activity of platelets, applied in cf-LVAD recipents who are trated with different ASA regimens. Materials and Methods: Experimental activities have been performed into the Haemostasis and Thrombosis Research Laboratory of the San Raffaele Hospital (HSR). The PAS assay was used to evaluate the platelet pro-thrombotic profile. Data were compared among patients receiving warfarin+ASA (ASA population) vs those who were discontinued from ASA following a bleeding event and who have never taken ASA (NO ASA population). Results were correlated with coagulation parameters (platelet count, INR, PTT, hematocrit, hemoglobin, LDH, Antithrombin III, fibrinogen and d-dimer) and clinical outcomes (thrombotic and bleeding events). The experimental protocol for the PAS assay requires the collection of platelet rich plasma (PRP) from a whole blood sample taken from a cf-LVAD patient. The PRP is filtered through a gel-filtration column to obtain a suspension of platelets (Gel-Filtered Platelets, GFP) free of plasma components, which is then diluted to a constant concentration of 20.000 plt/μL. The platelets are then exposed to Ac-FII for 10 minutes at 37 °C – in addition to FXa and Ca2+ needed to rebuilt the prothrombinase complex – to quantify the thrombin production rate as a marker of PA. The amount of thrombin generated from the GFP sample is quantified by spectrophotometric analysis, where chromozyn-TH is the thrombin-specific chromogenic peptide substrate. The spectrofotometer detects the dynamics of absorbance value’s variation over a predetermined time interval: the slope of the line that interpolates the absorbance-time points is an index of the thrombin quantity produced by the platelet sample. The analysis is performed both on a non-stimulated GFP sample and on a sonicated GFP sample (for 10 seconds, 20 W). The PA level of the subject (PAS value) is expressed as a percentage of its maximum potential of activation – i.e. PAS value obtained from the sonicated sample. For each patient, the PAS assay has been performed in duplicate to in- crease data consistency. Results: The study population comprises 59 patients implanted with the indication for DT treatment. Of these, 17 (29%) are in the ASA group and 42 (71%) in the NO ASA group. In the study population, 7 (12%) thrombotic events and 21 (36%) bleeding events were recorded; bleeding events were followed by ASA withdrawal. In the 21 patients of the Post-withdrawal ASA group, no recurrent haemorrhagic episode were recorded over a median follow-up period of 167 days. Analyzes revealed that stopping the drug following a bleeding event, significantly reduces the bleeding risk (no bleeding episodes after stopping), without however increasing the thrombotic risk. Considering the two study populations tested (ASA and NO ASA), an analysis was carried out to compare their PAS values. The data does not reveal a statistically significant difference in the PAS values between the ASA and NO ASA group. The comparison between Never ASA and Post-suspension ASA groups reveals that PAS values of patients who have never taken ASA are greater than the PAS values of patients discontinued from ASA; similarly comparing the PAS values before and after drug withdrawal, the post-withdrawal PAS values are significantly higher than the pre-withdrawal values. In addition, no statistically significant differences PAS values were observed in patients implanted with different devices except for patients implanted with HM3 for whom a higher average PAS value was recorded for the NO ASA population compared to the ASA population. Conclusion: The change in drug therapy, and in particular the discontinuation of ASA following a bleeding event,, does not suggest, according to this study, a significant increase in the risk of thrombotic events; conversely, ASA discontinuation contributes to significantly reduce and limit the incidence of recurrent bleeding events. The importance of accurate and systematic monitoring of the pro-thrombotic activity of platelets (such as that obtained through the use of the PAS assay) is underlined, in order to be able to promptly identify important potential alterations in platelet reactivity in patients treated without ASA, in order to quikly change drug therapy and thus prevent possible adverse events. The definition of pharmacological strategies tailored to the patient supported by systematic analysis of platelet function could contribute prospectively to improve LVAD hemocompatibility and consequently long-term results.

Introduzione: L’insufficienza cardiaca avanzata (advanced Heart Failure, aHF) rappresenta la fase inoltrata di molteplici condizioni patologiche del cuore e delle arterie coronarie. Questa condizione compromette seriamente la funzionalità cardiaca, causando una portata sanguigna agli organi sistemici del tutto inadeguata. Attualmente le misure preventive e le terapie mediche si sono rivelate inefficaci nel contrastare e/o ridurre la morbilità e la mortalità associate all’aHF. L’unica terapia in grado di risolvere questa patologia è il trapianto di cuore, che però non è disponibile per tutti i pazienti a causa della carenza di organi e dei rigidi criteri di selezione dei candidati al trapianto. Grazie agli sviluppi bioingegneristici degli ultimi 50 anni, i dispositivi meccanici di supporto circolatorio (Mechanical Circulatory Support devices, MCS devices) rappresentano oggi una valida soluzione per il trattamento dei pazienti affetti da aHF. Tra questi, i più idonei al trattamento a lungo termine sono i dispositivi di assistenza ventricolare (Ventricular Assist Device, VAD), in particolare i VAD a flusso continuo atti a supportare la funzionalità del ventricolo sinistro (Continuous Flow-Left Ventricular Assist Device, cf-LVAD). Allo stato dell’arte, questi dispositivi sono pompe miniaturizzate impiantabili, alimentate elettricamente, all’interno delle quali un impeller rotante fornisce l’energia propulsiva per direzionare un flusso continuo di sangue dall’apice del ventricolo sinistro all’aorta. In questo modo il dispositivo supporta meccanicamente la funzione di pompaggio del ventricolo e, nei casi più gravi, la sostituisce completamente. Questo lavoro di tesi nasce dalla collaborazione tra il Gruppo di Biomeccanica del Dipartimento di Elettronica, Informazione e Bioingegneria (DEIB) del Politecnico di Milano e l’Università Vita Salute San Raffaele (UniSR) di Milano. L'obiettivo della tesi è di valutare, tramite l'esecuzione di un test diagnostico sperimentale, qual è il ruolo della terapia farmacologica antitrombotica, e in particolare il contributo dell'Aspirina (ASA), farmaco antiaggregante, nel limitare l'attivazione piastrinica nei pazienti LVAD e prevenire dunque possibili eventi trombotici. Infatti sebbene lo sviluppo della tecnologia cf-LVAD offra una percentuale di sopravvivenza dell’85% a un anno dall’impianto e nonostante i notevoli miglioramenti apportati nell’affidabilità dai dispositivi di ultima generazione, il trattamento con cf-LVAD non è privo di complicanze post-impianto dovute alla complessa interazione pompa-paziente, in particolare: trombosi ed emorragia. La trombosi (trombosi della pompa e stroke ischemico) rappresenta la più temuta complicanza post-impianto ed è strettamente legata all’alterazione dell’emodinamica fisiologica causata dal cf-LVAD. In particolare, gli elevati sforzi di taglio (100-500 Pa) generati dalle alte velocità di rotazione dell’impeller della pompa, necessarie per garantire portate sanguigne fisiologiche, sono responsabili dell’attivazione piastrinica (Platelet Activation, PA), determinante fondamentale per la formazione del trombo. Per limitare la PA e prevenire gli eventi trombotici, ai pazienti portatori di LVAD viene somministrata quotidianamente una combinazione di farmaci antiaggreganti e anticoagulanti (generalmente aspirina e warfarin, rispettivamente). Il primo è un inibitore irreversibile dell’enzima ciclossigenasi che è responsabile della produzione del trombossano, elemento fondamentale nell’aggregazione piastrinica. Il secondo è un antagonista della vitamina K, necessaria per l’attivazione di vari fattori della coagulazione. Tuttavia, gli effetti negativi causati dalla terapia cf-LVAD (sindrome di von Willebrand acquisita, malformazioni arterovenose e mutazioni della mucosa gastrointestinale) combinati con l’assenza di un regime terapeutico antitrombotico paziente-specifico, comporta l’insorgenza di complicanze di tipo emorragico. Risulta quindi fondamentale monitorare, per tutta la durata del trattamento, lo stato di attivazione piastrinica, al fine di valutare la risposta paziente-specifica ai farmaci e al dispositivo e per verificare che il soggetto non sia a rischio di eventi avversi. In realtà, nella pratica clinica, il monitoraggio dei pazienti LVAD si basa principalmente sulla misura dell’International Normalized Ratio (INR), che valuta anche l’efficacia dei farmaci anticoagulanti (come il Warfarin). Tuttavia, non esiste alcun test o parametro utilizzato per valutare gli effetti dell’ASA, una delle possibili cause dell’insorgenza di eventi emorragici. Pertanto, il presente lavoro di tesi si propone di utilizzare un saggio chimico, il Platelet Activity State (PAS) assay, applicato in pazienti portatori di cf-LVAD sottoposti a diversi regimi antitrombotici, al fine di quantificare la trombina prodotta dalle piastrine e correlarla con il loro livello di attivazione, fornendo, in tal modo, un’indicazione paziente-specifico del profilo pro-trombotico delle piastrine. Materiali e metodi: Le attività sperimentali sono state svolte presso il Laboratorio di Ricerca di Emostasi e Trombosi dell’OSR. Si è utilizzato il PAS assay per valutare il profilo pro-trombotico delle piastrine. Nello studio sono stati coinvolti, ove possibile rispetto al quadro clinico, i pazienti portatori di un cf-LVAD a cui è stata prescritta una terapia antiaggregante e anticoagulante. La popolazione di studio è stata suddivisa in due gruppi in base al regime terapeutico seguito al momento del test (ASA e NO ASA); in particolare, i pazienti non trattati con ASA a loro volta sono stati suddivisi in due sottogruppi: i) pazienti che non hanno mai assunto ASA (Never ASA) e pazienti che l’hanno sospesa in seguito ad un evento emorragico (Post-sospensione ASA). Inoltre, durante la campagna sperimentale, sono stati registrati e/o misurati i parametri clinici ed il profilo coagulativo di ciascun paziente al fine di poter effettuare un ulteriore confronto riguardante lo stato coagulativo dei pazienti portatori di un cf-LVAD. Infine, per ciascun gruppo, sono stati registrati gli eventi avversi di natura trombotica ed emorragica. L’incidenza di tali eventi è stata poi confrontata tra le varie popolazioni Il protocollo sperimentale per il PAS assay prevede l’estrazione del plasma ricco di piastrine (PRP), in seguito a centrifugazione, da un campione di sangue intero prelevato da un paziente portatore di cf-LVAD. Il PRP viene filtrato mediante una colonna per filtrazione su gel per ottenere una sospensione di piastrine priva delle componenti plasmatiche (Gel-Filtered Platelets, GFP), che viene successivamente diluita fino a raggiungere una concentrazione costante di 20.000 plt/μL. Le piastrine vengono quindi esposte al Ac-FII per 10 minuti a 37°C – in aggiunta di FXa e di 〖Ca〗^(2+) necessari per ricostruire il complesso protrombinasi – al fine di quantificare la produzione di trombina, marcatore universalmente riconosciuto della PA. La quantità di trombina generata dal campione viene quantificata da un’analisi spettrofotometrica, grazie all’aggiunta della cromazina-TH come substrato peptidico cromogenico specifico per la trombina. Lo spettrofotometro rileva la dinamica di variazione del valore di assorbanza del campione durante un intervallo di tempo prestabilito (7 minuti): la pendenza della retta interpolante i punti assorbanza-tempo è indice della quantità di trombina prodotta. L’analisi viene eseguita sia su un campione di GFP non stimolato (basale) sia su un sonicato (per 10 secondi a 20 W). Il livello di PA del soggetto in esame (valore di PAS) viene espresso in termini percentuali rispetto al suo massimo potenziale di attivazione, ottenuto dal campione sonicato. Per ciascun paziente, il PAS assay è stato eseguito in duplicato per aumentare la consistenza dei dati sperimentali. Risultati: La popolazione di studio è composta da 59 pazienti impiantati con l’indicazione al trattamento DT. Di questi, 17(29%) appartenenti al gruppo ASA e 42 (71%) appartenenti al gruppo NO ASA. Nella popolazione di studio sono stati registrati 7 (12%) eventi di natura trombotica e 21 (36%) episodi di natura emorragica con conseguente sospensione dell’ASA. Nei 21 pazienti appartenenti al gruppo Post-sospensione ASA non è stato registrato nessun episodio ricorrente di tipo emorragico in un periodo di follow-up mediano di 167 giorni. Dalle analisi è emerso che la sospensione del farmaco a seguito di un evento di sanguinamento contribuisce a ridurre sensibilmente il rischio emorragico (nessun episodio di bleeding dopo la sospensione) senza tuttavia incrementare il rischio trombotico. Considerando le due popolazioni di studio testate (ASA e NO ASA), è stata effettuata un’analisi per confrontarne i valori di PAS. Dai dati non emerge una differenza statisticamente significativa nei valori di PAS tra la popolazione ASA e NO ASA. Nel confronto tra Never ASA e Post-sospensione ASA, i valori di PAS dei pazienti che non hanno mai assunto ASA sono maggiori rispetto i valori di PAS dei pazienti che l’hanno sospesa e, confrontando i valori di PAS prima e dopo la sospensione del farmaco, i valori di PAS post-sospensione sono significativamente più alti di quelli pre-sospensione. In aggiunta, a parità di dispositivo, al variare della terapia farmacologica, non sono state riscontrate differenze statisticamente significative fatta eccezione per i pazienti impiantati con HM3 per i quali è stato registrato un valore medio di PAS maggiore per la popolazione NO ASA rispetto alla popolazione ASA. Conclusioni: La variazione della terapia farmacologica, e in particolare la sospensione dell’ASA dal regime antitrombotico, non suggerisce, secondo questo studio, un aumento significativo del rischio di eventi trombotici, coerentemente con i dati clinici e con i risultati dell’analisi dell’attivazione piastrinica nelle due popolazioni; al contrario da questo studio emerge che la sospensione di aspirina a seguito di un evento emorragico limita significativamente l’incidenza di nuovi episodi di sanguinamento. Viene sottolineata l’importanza di un monitoraggio rigoroso e sistematico dell’attività pro-trombotica delle piastrine (come quello ottenuto mediante l’utilizzo del PAS assay), in modo da poter identificare tempestivamente importanti potenziali alterazioni nella reattività piastrinica in pazienti trattati senza ASA, al fine di modificare rapidamente la terapia farmacologica e prevenire così possibili eventi avversi. La definizione di strategie farmacologiche su misura per il paziente supportato da analisi sistematiche della funzionalità piastrinica, infatti, potrebbe contribuire in modo prospettico a migliorare l’emocompatibilità LVAD e di conseguenza i risultati a lungo termine della terapia della aHF tramite i dispositivi MCS.