A novel procedure for imaging the elastic network of knee ligaments

The human knee is a complex joint which plays a main role in daily activities, as walking, running, sitting and standing. However, it is also highly subjected to injuries and damages, especially related to ligaments. Therefore, the fields of surgery and of scientific research concerning knee ligaments are constantly evolving. For example, it is known nowadays that ligaments and tendons are mainly composed of water and collagen, as well as elastin and other cells in smaller quantities within the extracellular matrix. The fascicular structure of collagen fibres is also known, however there isn’t yet a precise understanding of the spatial architecture of elastic fibres throughout knee ligaments. That investigation is then the goal of the present thesis work. In fact, such knowledge would serve as a baseline for studying alterations due to aging or diseases and for innovating the field of surgery and of implantable artificial ligamentous tissue. First of all, an in-depth study of the state of the art was necessary, starting with the anatomy of the knee and its components, up to an accurate analysis of the techniques used to date to investigate the microstructure of connective tissues. Femur, tibia and kneecap are the principal bones of the knee, then the fibula is strictly related even if it’s not properly part of that joint. Between bones, friction is avoided and lubrication maintained thanks to the menisci, the articular cartilage and the bursae, while connection between bones is made by ligaments. Lateral collateral (LCL) and medial collateral ligaments (MCL) extend vertically respectively from the femoral external epicondyle to the head of the fibula and from the internal epicondyle to the head of the tibia. anterior (ACL) and posterior cruciate ligaments (PCL) are attached respectively anteriorly and posteriorly to the intercondylar eminence of the tibia and run diagonally up to the inner aspect of the opposite femoral condyle. Due to their position, collaterals stretch during extension and relax during flexion, they reinforce the articular capsule sides and assure transversal stability during extension. While cruciate ligaments, which are placed at the centre of the articulation, balance the knee and contain anterior-posterior movements. In particular, the PCL supports the knee when it is flexed and weight bearing, preventing the femur from sliding anteriorly off the top of the tibia. It also stabilizes against external rotation of the tibia and excessive varus or valgus angulation. Instead the ACL resists hyperextension of the knee and anterior translation of the tibia on the femur. Furthermore, it acts as secondary stabilizer against internal rotation of the tibia and valgus angulation. As previously mentioned, the dry weight of ligament consists of few cells and a large amount of matrix, which is made up of three basic components: elastin fibres, collagen fibres and ground substance, also called tissue fluid or extracellular fluid. Elastin molecules are generally oriented in multiple directions and, as fibres are stretched, they tend to straighten, modifying their spatial organization and allowing the fibres to reach approximately 200% of their resting length. Hence, elastin is responsible for the elastic properties of ligaments, even if it accounts for a very low percentage of the dry weight (<5%). In contrast, collagen molecules, which constitute about 90% of the ligament dry weight, are regularly arranged and make the ligament highly resistant to tensile loading and to stretch. In fact, they tend to align parallel and run in the same overall direction, and they associate to form microfibrils (3-4 nm in diameter), then subfibrils (10-20 nm in diameter), fibrils (50-500 nm in diameter), fibril bundles (0.5-3 micrometers in diameter), fibres (approximately 40-60 micrometers in diameter), fascicle of fibres (50-300 micrometers), and finally multiple fascicles compose the ligament. Due to this structure, when collagen fibers are stretched, all their constituents straighten very quickly and the amount of extension results to be limited to approximately 10%. Literature collects several techniques, developed throughout the years, for the isolation and visualization of microstructural components in soft tissues, in particular ligaments, intervertebral discs and vessel walls of human and animal models. Schematically, they can be classified into histological techniques, biochemical techniques and a combination of the two. Histological processes are characterized by fixation, embedding, staining and examination with electron or light microscope. In particular, elastic fibres may be stained selectively by orcein or resorcin-fuchsin, or through other staining procedures such as Verhoeff's, Mc-Manus' periodic acid-Schiff, basic fuchsin, nile blue sulfate. Results from different studies showed morphological features specific to individual tissues and organs: elastic fibres in different parts of the body differed from one another in terms of diameter, aggregation, intensity of staining, affinity for calcium salts and amino acid composition. This suggests that the elastic fibre is not a unitary or homogeneous tissue element. Biochemical processes consist in degrading certain components and observing residuals through a microscope, generally a SEM. These methods seem to be very functional for isolation and visualization of elastic fibres, since it’s demonstrated that covalent crosslinks between elastin units give to the elastin network the properties of insolubility and resistance to high temperature, therefore heat treatments and specific tissue digestions can be conducted in order to maintain intact this network only. Some examples of biochemical methods, which have been studied since the 70s to degrade non elastic components, are enzymatic digestion with reagents like collagenase, trypsin or cathepsin K, and alkali digestion in solutions such as potassium hydroxide or sodium hydroxide. One of these alkali digestion techniques was the main basis for the development of the present experimental work. In fact, between 2017 and 2018 Tavakoli and Costi developed a protocol for the isolation of the elastic network in the annulus fibrosus of the intervertebral disc using sodium hydroxide digestion followed by heat treatment in water. Afterwards, they visualized the results under a Scanning Electron Microscope. Samples were cut from the annulus fibrosus (first animal and then human) and a 0.5 N NaOH solution was used as digestion medium, obtained mixing 2.5 g NaOH in 125 ml deionized water. In general, NaOH digestion might not give biochemically pure elastin (a slight amount of debris might be noticed) but it guarantees no overdigestion of the elastic component, leaving even the smallest fibres unbroken. Given the efficiency of that protocol on the intervertebral disc, the same choices were made here for the microstructural investigation of knee ligament. However, only animal models were considered, specifically sheep, because of the analogies between sheep and human knee in terms of size and anatomy. Cruciate and collateral ligaments were severed from the stifle joint of a sheep and stored at -20°C. Once frozen, they were divided into pieces nearly 10 mm x 10 mm and slices 30-micrometers-thick were cut using a cryostat. The specimens obtained from different regions and ligaments were stored in different petri dishes, kept frozen and separately processed. Initially one or a few more samples were treated in each experiment, subsequently the batteries were extended to 10 samples each. They always had to be handled gently with delicate forceps because they were extremely fragile. After inserting the samples into the digestion medium, in order to accelerate the tissue degradation, a sonication was performed with an ultrasonic processor at 25 kHz frequency and at room temperature. Then, samples were rinsed for 5 minutes in distilled water and heat treated in a water bath previously set to 70°C. Distilled water was supposed to remove remnants of sodium hydroxide while hot water remnants of collagen, always maintaining elastic fibers intact. In order to observe the obtained results under a SEM, samples had to be dehydrated through a series of ethanol solutions with increasing ethanol concentration (30% ethanol solution for 2 minutes, 70% ethanol solution for 2 minutes and 90% ethanol solution for 30 seconds). Thus, they were gently stuck with conductive carbon adhesive tape on SEM stubs and dried for 5 hours in a vacuum oven at 37 °C and -80 kPa. The first experiments were made with a 0.5 N NaOH solution on samples from the proximal region of a ovine MCL and from the distal region of an ACL. However, this concentration seemed to be inadequate. In fact, with a sonication of 20 minutes or less, even though the SEM images revealed light signs of degradation with respect to untreated samples, the tissue was still not digested enough to see the substructures of interest. However, increasing time, the samples completely disappeared in the solution and there was no possibility to observe them at all. Therefore, a 0.25 N solution was then used, so the time of sonication was progressively increased, up to 80 minutes, and its effects were observed on the tissue. Moreover, a second decision was taken at this point to only treat samples obtained from central regions of cruciate ligaments. This was introduced because, with respect to collaterals, cruciates have more significant mechanical properties, a greater tendency to trauma and surgeries and, consequently, a richer bibliographic material to make a comparison with, as well as a greater interest in medicine and science. There are two reasons why the central region was chosen instead: to try to reduce the variability of results and because near bone attachments the tissue has a transition zone where the concentration of chondrocytes increases and it is more calcified. Another way to respond to the high variability of results, was increasing the size of the batteries to ten samples each, as mentioned above. After drying, samples were coated with a 5-nm-layer of platinum and inserted in the SEM chamber in order to be observed. For all samples, setting parameters were always the same (5 kV accelerating voltage, 3 nm spot size, 17-20 mm working distance), while magnification was widely varied in order to capture images of the entire samples at low magnification and it was then increased where effects of digestion seemed to be more visible, which was typically near the boundaries of samples. The level of degradation was evaluated qualitatively by observing collected images and comparing them with the state of the art, and above all with the results of Tavakoli and Costi, since the level of detail they obtained on the intervertebral disc is what this research wanted to achieve on the articular ligaments. In addition, when the presence of fibres was recognizable, ImageJ open source software was used to measure their thickness and orientation and these data as well were compared to what is reported in the literature. Moreover, an attempt of quantitative evaluation of digestion was made with the 10-pcs-batteries by calculating weight loss due to treatment: the battery of samples was weighed on an analytical balance before the sonication and after drying in the oven and the weight loss was calculated as the difference between the two measures. In observing the high number of SEM images collected, some signs of different stages of tissue degradation could be recognized: the surface of the samples did not look smooth and plain (as the non-digested samples) but granular. Moreover in several cases fenestrations of various sizes were randomly scattered, and fibrillar structures emerged. However, other images, even from the same samples, did not give any information about the internal architecture of the ligaments. The degradation in fact is an heterogeneous process on the sample and it could also be that some degraded regions weren’t revealed under the microscope, for example because they were on the side of the sample facing the stub or in other hidden regions. Anyway, even where a degradation was evident, it was difficult to define what was represented, in particular whether the fibers were collagen or elastin. Apart from the comparison with previous research, one feature that could help to distinguish them was their different arrangement in space, described earlier. Moreover, articular ligaments are mostly made of collagen while elastin content is only a few percentage units, so elastic fibres were expected to have a very low spatial density with respect to collagen. The images where a fibrous network was particularly evident were the ones obtained from PCL samples sonicated 45 minutes and not heat treated, therefore the fibers were probably both collagenous and elastic, since heat treatment was supposed to remove collagen residues. In fact, these images report thicker fibers (approx 0.4-0.6 micrometers diameter) that develop mostly longitudinally and some thinner fibers (approx 0.2 micrometers diameter or less) that join the first ones transversely. However there is still no certainty about their nature. In general, results showed that an increase in sonication time didn’t always correspond to an increase in tissue digestion, on the contrary, the effects seemed very variable and unpredictable, which was an unexpected result. Hence, according to what is found in literature, this work was the very first investigation of alkali digestion effects on knee ligaments, but it represents the beginning of a research that must be carried on, deepened and improved. For example, other experiments with long sonication should be conducted in order to have a wider range of results. In addition, a slight increase in concentration of NaOH in the digestion medium (e.g. between 0.3 N and 0.4 N) should be attempted since it may induce a better and faster digestion of the tissue. Also, the introduction of specific precision instrumentation, such as a more precise lab scale or more delicate forceps, could allow greater accuracy throughout the process. Finally, a more complete study would be obtained integrating the present investigation with an histological one on the same tissue.

Il ginocchio è un'articolazione complessa che svolge un ruolo principale nelle attività quotidiane come camminare, correre, sedersi e stare in piedi, tuttavia è anche facilmente soggetto a lesioni soprattutto per quanto riguarda i suoi legamenti. Proprio per questo è in continua evoluzione la ricerca in ambito scientifico e chirurgico. Ad oggi è noto che i legamenti e i tendini sono composti principalmente da acqua e collagene e in quantità minore da elastina e altre cellule; è nota anche la struttura fascicolare delle fibre di collagene, ma non vi è ancora conoscenza dettagliata sull'architettura spaziale delle fibre elastiche, conoscenza che potrebbe rivelarsi decisiva al fine di implementare lo studio delle alterazioni dovute a malattie o all'invecchiamento delle strutture osteo-articolari nonché innovare il campo della chirurgia e lo sviluppo di materiali artificiali impiantabili. È dunque questa ricerca a livello microscopico l'obiettivo del presente lavoro di tesi. È stato necessario innanzitutto lo studio dello stato dell'arte, partendo dall'anatomia del ginocchio e delle sue componenti fino ad un'analisi accurata delle tecniche utilizzate per indagare la microstruttura dei tessuti connettivi. Femore, tibia e rotula sono le ossa principali dell'articolazione del ginocchio, mentre il perone è strettamente correlato pur non essendo propriamente parte di essa. L'attrito tra ossa è prevenuto grazie alla presenza dei menischi, della cartilagine articolare e delle borse sierose, mentre la continuità viene garantita dai legamenti. I legamenti collaterali laterale e mediale (LCL e MCL) si estendono verticalmente rispettivamente dall'epicondilo femorale laterale alla testa del perone e dall'epicondilo mediale alla testa della tibia. I legamenti crociati anteriore e posteriore (ACL e PCL) si inseriscono rispettivamente anteriormente e posteriormente l’eminenza intercondiloidea e corrono diagonalmente fino al condilo femorale opposto. Grazie alla loro posizione i collaterali si allungano durante l'estensione e si rilassano durante la flessione rinforzando i lati della capsula articolare e assicurando la stabilità trasversale durante l'estensione. I legamenti crociati invece, posizionati al centro dell'articolazione, bilanciano il ginocchio e contengono i movimenti antero-posteriori. In particolare, il crociato posteriore sostiene il ginocchio quando è flesso evitando lo slittamento anteriore del femore sulla tibia. Inoltre, interviene contrastando la rotazione esterna della tibia limitando varismo e valgismo. Il crociato anteriore resiste invece all'iperestensione del ginocchio e alla traslazione anteriore della tibia sul femore; ha anche funzione di stabilizzatore secondario contro la rotazione interna della tibia e l'angolazione del valgo. Come accennato, il legamento è costituito da poche cellule e molta matrice, composta da elastina, collagene e fluido tissutale. Le molecole di elastina sono generalmente orientate in più direzioni e quando le fibre vengono allungate tendono a raddrizzarsi, modificando la loro organizzazione spaziale, in questo modo le fibre possono raggiungere circa il 200% della loro lunghezza a riposo. Pertanto l'elastina è responsabile delle proprietà elastiche dei legamenti nonostante sia presente in percentuale molto bassa (<5%); al contrario le molecole di collagene, che costituiscono circa il 90% del peso secco, rendono il legamento molto resistente al carico a trazione grazie alla loro ordinata organizzazione spaziale. Infatti corrono per lo più parallelamente nella stessa direzione complessiva, e si associano a formare innanzitutto microfibrille (3-4 nm di diametro), che a loro volta formano sottofibrille (10-20 nm), fibrille (50-500 nm), fasci di fibrille (0,5-3 micrometri), fibre (circa 40-60 micrometri), fascicoli di fibre (50-300 micrometri), e infine gruppi di fascicoli compongono il legamento. A causa di questa struttura, quando le fibre di collagene vengono allungate, tutti i loro costituenti si raddrizzano molto rapidamente e la quantità di estensione risulta limitata a circa il 10%. La letteratura raccoglie diverse tecniche, sviluppate nel corso degli anni, per l'isolamento e la visualizzazione di componenti microstrutturali nei tessuti molli in particolare legamenti, dischi intervertebrali e pareti dei vasi di modelli umani e animali. Schematicamente possono essere classificati in tecniche istologiche, tecniche biochimiche e una combinazione delle due. I processi istologici sono caratterizzati da fissazione, incorporazione, colorazione ed esame al microscopio elettronico o al microscopio ottico. In particolare le fibre elastiche possono essere colorate selettivamente con orceina, resorcin-fuchsina, fucsina basica o blu nilo, o attraverso altre procedure di colorazione come quella di Verhoeff e quella con l'acido di Mc-Manus. I risultati di diversi studi hanno mostrato caratteristiche morfologiche specifiche per i singoli tessuti e organi: le fibre elastiche in diverse parti del corpo differivano tra loro in termini di diametro, aggregazione, intensità della colorazione, affinità per i sali di calcio e composizione amminoacidica. Questo suggerisce che la fibra elastica non è un elemento tissutale unitario o omogeneo. I processi biochimici consistono nel degradare alcuni componenti e nell'osservare i residui attraverso un microscopio, generalmente un SEM. Questi metodi sembrano essere molto funzionali per l'isolamento e la visualizzazione delle fibre elastiche poiché è dimostrato che le reticolazioni covalenti tra le unità di elastina conferiscono alla rete di elastina le proprietà di insolubilità e resistenza alle alte temperature, quindi si possono effettuare trattamenti termici e digestioni tissutali specifiche per mantenere intatta solo questa rete. Alcuni esempi di metodi biochimici, che sono stati studiati fin dagli anni '70 ad oggi per degradare i componenti non elastici, sono la digestione enzimatica con reagenti come collagenasi, tripsina o catepsina-K, e la digestione alcalina in soluzioni come l'idrossido di potassio o idrossido di sodio. Una di queste tecniche di digestione alcalina è stata la base principale per lo sviluppo del presente lavoro sperimentale. Infatti tra il 2017 e il 2018 Tavakoli e Costi hanno sviluppato un protocollo per l'isolamento della rete elastica nell'anulus fibroso del disco intervertebrale utilizzando la digestione in idrossido di sodio seguita da un trattamento termico in acqua e visualizzando poi i risultati al microscopio elettronico a scansione. I campioni sono stati tagliati dall'anulus (prima animale e poi umano) e come mezzo di digestione è stata utilizzata una soluzione di NaOH 0.5 N, ottenuta mescolando 2,5 g di NaOH in 125 ml di acqua deionizzata. In generale la digestione in NaOH potrebbe non dare elastina biochimicamente pura (si potrebbe notare una leggera quantità di detriti) ma garantisce l'assenza di sovradigestione della componente elastica lasciando intatte anche le fibre più piccole. Data l'efficienza di quel protocollo sul disco intervertebrale, le stesse scelte sono state fatte qui per l'indagine microstrutturale dei legamenti di ginocchio, prendendo in considerazione modelli animali ovini, data l’analogia tra ginocchio di pecora e umano in termini di dimensioni e anatomia. I legamenti crociati e collaterali sono stati recisi dall'articolazione di una pecora e conservati a -20°C. Una volta congelati, sono stati divisi in pezzi di circa 10 mm x 10 mm e con un criostato sono state tagliate fette di 30 micrometri di spessore. I campioni ottenuti da diverse regioni e legamenti sono stati conservati in freezer in differenti contenitori e trattati separatamente. Inizialmente uno o pochi altri campioni sono stati trattati in ogni esperimento, successivamente le batterie sono state estese a 10 campioni ciascuna. La loro estrema fragilità ha imposto la massima cura nel maneggiamento. Dopo aver inserito i campioni nel mezzo di digestione, al fine di accelerare la degradazione dei tessuti è stata eseguita una sonicazione con un processore ad ultrasuoni a 25 kHz di frequenza e a temperatura ambiente. Successivamente i campioni sono stati risciacquati per 5 minuti in acqua distillata e trattati termicamente in un bagno d'acqua precedentemente regolato a 70°C. Il passaggio in acqua distillata è finalizzato a rimuovere i residui di idrossido di sodio mentre quello in acqua calda i residui di collagene, mantenendo intatte le fibre elastiche. Per effettuare l’osservazione al SEM è stato necessario disidratare i campioni attraverso una serie di soluzioni di etanolo con concentrazione crescente (soluzione di etanolo al 30% per 2 minuti, al 70% per 2 minuti e al 90% per 30 secondi). Quindi sono stati fissati sugli stub del SEM con del nastro adesivo conduttivo ed essiccati per 5 ore in forno sottovuoto a 37°C e -80 kPa. I primi esperimenti sono stati eseguiti con una soluzione di NaOH 0.5 N su campioni prelevati dalla regione prossimale di un MCL ovino e dalla regione distale di un ACL. Questa concentrazione è risultata inadeguata in quanto con una sonicazione di 20 minuti o meno, anche se le immagini al SEM hanno rivelato leggeri segni di degradazione rispetto ai campioni non trattati, il tessuto non risultava ancora abbastanza digerito per individuare le sottostrutture di interesse. Tuttavia aumentando il tempo i campioni sono completamente scomparsi nella soluzione e non c'è stata alcuna possibilità di osservarli. Pertanto si è iniziato ad utilizzare una soluzione a 0.25 N aumentando progressivamente il tempo di sonicazione fino ad un massimo di 80 minuti e i suoi effetti sono stati osservati sul tessuto. Inoltre, si è deciso di trattare solo campioni ottenuti da regioni centrali dei legamenti crociati perché, rispetto ai collaterali, hanno proprietà meccaniche più significative. Oltre a ciò, la maggiore tendenza a traumi e conseguentemente ad interventi chirurgici offre materiale bibliografico più ricco e maggiore interesse per la medicina e la scienza. Due sono i motivi per cui è stata invece scelta la regione centrale: per cercare di ridurre la variabilità dei risultati e perché vicino alle inserzioni ossee il tessuto presenta una zona di transizione con aumentata concentrazione di condrociti. Un altro modo per rispondere all'elevata variabilità dei risultati, è stato quello di aumentare le dimensioni delle batterie a dieci campioni ciascuna, come detto sopra. Dopo l'essiccazione i campioni sono stati rivestiti con uno strato di 5 nm di platino e inseriti nel SEM per essere osservati. Per tutti i campioni sono stati fissati la tensione di accelerazione (5 kV), il diametro dello “spot” (3 nm) e la distanza di lavoro (17-20 mm) mentre l'ingrandimento è stato variato al fine di osservare le aree dove gli effetti della digestione apparivano più rilevanti, tipicamente vicino ai confini dei campioni. Il livello di degradazione è stato valutato qualitativamente osservando le immagini raccolte e confrontandole con lo stato dell'arte, soprattutto con i risultati di Tavakoli e Costi, poiché il livello di dettaglio ottenuto sul disco intervertebrale è quello che questa ricerca ha voluto ottenere sui legamenti articolari. Inoltre quando la presenza delle fibre era riconoscibile, per misurarne lo spessore e l'orientamento è stato utilizzato il software open source ImageJ e anche questi dati sono stati confrontati con quanto riportato in letteratura. È stato inoltre fatto un tentativo di valutazione quantitativa della digestione con le batterie da 10 pezzi calcolando la perdita di peso dovuta al trattamento: la batteria di campioni è stata pesata su una bilancia di laboratorio prima della sonicazione e dopo l'essiccazione in forno e la perdita di peso è stata calcolata come differenza tra le due misure. Osservando l'elevato numero di immagini SEM raccolte si sono potuti riconoscere alcuni segni di diversi stadi di degradazione dei tessuti: la superficie dei campioni non risultava liscia come i campioni non digeriti ma granulosa, in diversi casi si sono osservate fenestrature di varie dimensioni distribuite in modo apparentemente casuale, si evidenziava inoltre una struttura fibrosa. D'altra parte altre immagini, anche dagli stessi campioni, non davano alcuna informazione sull'architettura interna dei legamenti. La digestione infatti è un processo eterogeneo sul campione e potrebbe anche accadere che alcune regioni degradate non siano rilevabili al microscopio, ad esempio perché si trovano sul lato del campione rivolto verso lo stub o in altre regioni nascoste. In ogni caso anche in presenza di una evidente degradazione, è risultato difficile definire cosa fosse rappresentato e in particolare se le fibre fossero di collagene o di elastina. Oltre il confronto con le ricerche precedenti, una caratteristica che ha potuto aiutare a distinguerle è la diversa disposizione nello spazio, come descritto in precedenza. Inoltre i legamenti articolari sono per lo più costituiti da collagene mentre il contenuto di elastina è solo di poche unità percentuali, per cui ci si aspetta che le fibre elastiche abbiano una densità spaziale molto bassa rispetto al collagene. Le immagini che hanno mostrato in maniera particolarmente evidente una rete fibrosa sono quelle ottenute da campioni di PCL sonicati 45 minuti e non trattati termicamente, dove presumibilmente non vi è stata quindi una completa rimozione dei residui di collagene. Infatti, queste immagini riportano fibre più spesse (circa 0,4-0,6 micrometri di diametro) che si sviluppano per lo più longitudinalmente e alcune fibre più sottili (circa 0,2 micrometri di diametro o meno) che si uniscono alle prime trasversalmente. Tuttavia non c'è ancora certezza sulla loro natura. In generale i risultati hanno mostrato che un aumento del tempo di sonicazione non sempre corrispondeva ad un aumento della digestione dei tessuti, al contrario gli effetti sembravano molto variabili e imprevedibili, i risultato, questo, inaspettato. Possiamo concludere che secondo quanto ritrovato in letteratura questo lavoro può essere considerato una prima indagine sugli effetti della digestione alcalina sui legamenti del ginocchio, ma rappresenta l'inizio di una ricerca che deve essere sviluppata, approfondita e migliorata. A titolo esemplificativo possiamo dire che altri esperimenti con sonicazione lunga dovrebbero essere condotti per avere una più ampia disponibilità di risultati; inoltre si dovrebbe provare un leggero aumento della concentrazione di NaOH nel mezzo di digestione (ad esempio tra 0.3 N e 0.4 N) in quanto questa situazione potrebbe indurre una migliore e più veloce digestione del tessuto. Si è anche resa evidente la necessità di strumentazione maggiormente congrua a questa specifica attività di ricerca, in particolare l'introduzione di una bilancia da laboratorio ad alta precisione o una pinza più appropriata e altri strumenti che possano consentire una maggiore precisione durante tutto il processo. Infine si otterrebbe uno studio più completo integrando la presente indagine con una istologica sullo stesso tessuto.