Whole-brain analysis of resting state functional networks : a 3T fMRI twin study

In the last two decades, resting-state functional Magnetic Resonance Imaging (rs-fMRI) has become an extremely popular technique in the field of neuroimaging, as it can measure the spontaneous, low frequency fluctuations that appear in the BOLD signal (Blood Oxygen Level Dependent) used to investigate and analyse the functional architecture of the brain. The present thesis deals with the analysis of a big rs-fMRI dataset collected from a unique sample of young Italian twins. The experimental work has involved the implementation of methods for pre-processing and cleaning of the fMRI data and for the subsequent extraction of meaningful information on the brain network topology. Indeed, BOLD fMRI data are influenced by endogenous and exogenous non-neural processes that can affect the quality of the data obtained during resting-state experiment. Thus, “data denoising” represents a crucial step that influences the reliability of the subsequent fMRI data analyses. Spatial independent component analysis (ICA) has emerged as a valid alternative to regression analyses for fMRI clean up. The issue in the use of sICA for fMRI data cleaning is to accurately classify Independent Components (ICs) into noise and signal components. A classically and still widely used method is the manual classification of ICs. Recently numerous methods, based on different kinds of classifiers, have also been developed to automatically and selectively identify and remove noise-related ICs from fMRI data. Nevertheless, the application of these new tools is not always straightforward and might require big fMRI datasets for training. In this context, one part of this experimental thesis work is related to the development of a novel, fast and easy-to-use tool for subject-level ICA-based identification of fMRI artefacts. This novel tool can be used to advance from a slow, manual labelling of ICs to a fast, semi or fully automatic identification of noise-related ICs. The newly developed fMRI cleaning tool has been validated on an exemplar dataset and used in the processing pipeline of a big rs-fMRI dataset collected from 43 young couples of twins. Another, relevant focus of the present thesis regards the investigation of the brain mechanisms underlying the “resting state”, from which significant information on brain pathophysiology can be extracted. As has been said, fMRI images acquired during rest can be analysed to extract quantitative measures of the functional connectivity between brain regions based on temporal synchronization of spontaneous fluctuating rs-fMRI signals. Our understanding of large-scale functional brain networks has been revolutionized by the use of rs-fMRI. Indeed, during resting-state condition is possible to observe the human brain organized in multiple large-scale networks called resting-state networks (RSNs) associated to specific brain function. The human brain is active during rest condition and hierarchically organized into intrinsic functional networks. These functional networks are largely established early in development, then passing from childhood to adolescence is possible to report a more distributed organization. It remains a challenge studying the genetic and environmental influences on these functional brain networks and how such effects dynamically interact during the growth of the subject. In the last years, it has been introduced the idea that the analysis of RSNs and their topological characteristics can potentially be used to investigate functional connectivity changes that occur in the subjects during their development. In this context, the analysis of fMRI datasets from twin samples offers the unique opportunity of studying the heritability associated to RSNs, to evaluate the genetic bases of functional brain networks and the associated topological characteristics. Heritability represents the quantification of the overall phenotypic variation – in this case brain network functional variability - that is attributable to genetic factors. The application of heritability estimates is a medium for defining boundaries for the ability of genetics to predict disease and determine disease risks that can affect brain function. However, the critical investigation relies also on the examination of genetic and environmental impact on RSNs and their topological parameters. Twin studies provide an excellent platform for the analysis of genetic and environmental impact on a certain phenotype, taking advantage of the assumption that monozygotic twins carry identical genome, while dizygotic twins carry genome approximately 50% in common. The aim of the present study is to utilize statistical twin methods to investigate the cerebral function “in vivo” and provide insights into the extent of genetic and environmental effects on brain functional characteristic. After the optimized pre-processing and cleaning of the entire rs-fMRI dataset, we apply a Seed-based Functional connectivity analysis to estimate the functional connectivity established between brain regions. Firstly, is applied the parcellation of fMRI volumes based on AAL atlas, obtaining the region of interests (ROI) of the brain to be analysed. The ROIs that we extract, behave as nodes of the dynamic brain networks. Then, follows the ROI BOLD signal extraction by which we obtain the time series of the BOLD signal associated to each ROI. The BOLD time series of each ROI represents the dynamics of the voxels within the ROI. Subsequently, we use the BOLD time series of each ROI to obtain the Functional Connectivity matrices of Cross-Correlation, by applying the Pearson’s linear correlation coefficient between ROIs time series, and the Mutual Information matrix, obtained by calculating the Mutual information shared between ROIs time series. These two Functional Connectivity matrices represent the link-level parameters of the brain network, whose matrix elements indicate the functional connectivity links between couple of ROIs. Subsequently, a set of network-level and node-level topological parameters of the functional brain networks is estimated from the functional connectivity matrix of Cross-Correlation, for all subjects across monozygotic (MZ) and dizygotic (DZ) twin pairs. Then, the similarity of each topological parameter - extracted at the level of network, node or link between nodes – within each couple of twins was evaluated. This similarity analysis was separately performed on MZ and DZ couples separately by extracting the correlation between the values of the topological parameter across MZ/DZ couples at net of Age and Sex of the twin couples. This results in the estimation of intra-pair correlation values for MZ and DZ couples, rMZ and rDZ, which are used to estimate the rates of genetic and environmental influences on the considered topological parameter using twin models. Based on the comparison between rMZ and rDZ values, the most appropriate twin model was selected and if possible, used to estimate the genetic and environmental contributions, including also measures of heritability for each functional brain network parameter. The Fisher’s z-test was employed to assess the heritability significance starting from the correlation difference between MZ and DZ couples, associated to each topological parameter. In parallel, we evaluated possible effects of sex and age on the level of intra-pair similarity of the topological parameters at net of zygosity effect. Using multiple linear regression models, the intra-pair difference of each topological parameter was modelled in terms of zygosity, age and sex. This last analysis wants to capture whether age and sex can influence the difference of each topological parameter in the twin couples. From the intra-pair similarity analysis, we notice that the intra-pair correlation of each topological parameters between MZ couples results always higher than the intra-pair correlation evaluated between DZ couples. The higher intra-pair correlation differences between MZ and DZ couples have been found associated to the Mutual Information value between ROIs. This result suggests the hypothesis that functional connectivity between ROI based on non-linear interactions was characterized by a high genetic influence. Regarding the analysis of genetic and environmental influences, we couldn’t analyse Epistatic Effect or apply any twin model to the network-level parameter, due to the fact that all associated rDZ result negative, probably due to the low sample size. Otherwise, the genetic effects created by Epistasis result to be present in almost all functional connectivity links of the matrix of Mutual Information and Cross-correlation. On the other side, functional connectivity links between ROI couples, based on Mutual Information, result to be more suitable for genetic and environmental analysis based on the application of twin model and also to be associated to higher value of heritability, with respect to functional connectivity links of Cross-Correlation matrix. The genetic and environmental analysis is also applied on node-level parameters. For the majority of the nodes of node-level parameters that result suitable for twin model’s application, we notice an influence of the non-shared environment higher than 70%. From the quantitative analysis on the intra-pair correlation difference between MZ and DZ couples, we found a higher number of significant intra-pair correlation differences for the nodes and functional connectivity links associated to an Epistatic effect. In addition, functional connectivity links based on Mutual Information show higher number of significant intra-pair correlation difference with respect to Cross-Correlation links. From the last analysis related to the significant effect of sex and age on the intra-pair difference of each topological parameter, we do not find a significant effect of age or sex on the intra-pair difference of the network-level and link-level parameter. On the contrary, we have seen a significant effect of age and sex on the intra-pair similarity of node-level parameter. For the majority of the nodes we have found a negative correlation value between the age of the twin couple and the intra-pair difference of the node-level parameter, indicating a rise of intra-pair similarity for most of the node-level parameter by increasing the age of the twin couple. In conclusion, this experimental work of thesis has addressed the main technical challenges associated with both pre-processing and analysis of rs-fMRI data. A complete analysis pipeline has been implemented for the quantitative investigation of functional connectivity networks that have emerged to be active in the brain during the resting state condition, based on the extraction of a high number of network-, node- and link-level parameters. We consider this work of thesis an improvement for brain functional connectivity and topological parameter analyses applied to twin studies. We believe also that the obtained results can provide interesting insights into genetic and environmental effects on the functionality of brain networks that can be of great impact in clinical settings, unveiling important mechanisms underlying the onset of psychiatric and neurological illnesses.

Negli ultimi anni le tecniche relative all’acquisizione di immagini funzionali del cervello (fMRI) ottenute durante la condizione di resting-state del paziente, hanno acquisito popolarità nel campo del Neuroimaging. Grazie a queste tecniche è stato possibile misurare le oscillazioni spontanee a bassa frequenza che compaiono nel segnale BOLD (Blood Oxygenation Level Dependent) utilizzate per indagare e analizzare l’architettura funzionale della rete cerebrale. Tuttavia, i dati ottenuti tramite tecniche fMRI sono influenzati da processi non-neuronali endogeni ed esogeni che possono incidere sulla qualità delle immagini acquisite. Pertanto, l’eliminazione delle componenti artefattuali dai dati rappresenta un passaggio cruciale che influenza l’affidabilità e la correttezza dei successivi passaggi di elaborazione dei dati. Una valida alternativa ai metodi di regressione applicati per la pulizia dei dati fMRI è risultata essere l’analisi spaziale delle componenti indipendenti (ICA). Un punto chiave nell’uso della tecnica sICA per la procedura di pulizia dei dati, è la classificazione accurata delle componenti indipendenti (ICs) in componenti artefattuali o componenti di effettivo segnale. Il metodo classico, e ancora ampiamente utilizzato, è la classificazione manuale delle ICs. Recentemente sono stati sviluppati numerosi metodi, basati su diversi tipi di classificatori, per identificare e rimuovere selettivamente le ICs associate a componenti artefattuali presenti nei dati fMRI. Tuttavia l’applicazione di tali metodi non è sempre semplice e potrebbe richiedere l’utilizzo di grandi set di dati fMRI. A questo proposito, una parte di questo lavoro di tesi sperimentale è stata dedicata allo sviluppo di un nuovo, facile e intuitivo metodo di identificazione di componenti artefattuali nei dati fMRI, basandosi sulla tecnica ICA. Questo nuovo tool può essere utilizzato per progredire da un’etichettatura manuale, lenta delle ICs ad una identificazione più rapida, che può essere semi- o completamente automatica, delle ICs che non rappresentano un effettivo segnale neuronale di interesse. Il nuovo metodo di pulizia dei dati fMRI è stato validato su un dataset di esempio e successivamente utilizzato per l’elaborazione di un dataset rs-fMRI raccolto da 43 giovani coppie di gemelli. Un’altra parte rilevante da sottolineare in questo lavoro di tesi è relativa alla condizione di resting-state assunta dal paziente utilizzata per acquisire i dati fMRI, tenendo conto che da questa condizione è possibile estrarre informazioni significative. Come è stato precedentemente detto, le immagini funzionali del cervello acquisite durante la condizione di resting-state sono associate a misure di connettività funzionale tra regioni cerebrali caratterizzate dalla sincronizzazione temporale di segnali resting-state fMRI spontanei e oscillanti. La conoscenza delle reti cerebrali funzionali su larga scala è stata rivoluzionata dall’uso della risonanza magnetica funzionale acquisita in tali condizioni di riposo del paziente. Infatti, durante lo stato di resting-state è possibile osservare l’organizzazione cerebrale in più reti su larga scala chiamate reti dello stato di resting-state (RSNs), ognuna delle quali associata a specifiche funzioni cerebrali. Il cervello umano è quindi attivo durante le condizioni di riposo (resting-state) del paziente, e tende ad assumere un’organizzazione gerarchica formando reti funzionali intrinseche (RSNs). Queste reti funzionali sono formate in gran parte nella fase iniziale dello sviluppo del soggetto. Il passaggio dall’infanzia all’adolescenza in genere segna un cambiamento fondamentale nell’organizzazione di tali reti, che risultano infine avere un’organizzazione più solida. Un passo importante nella ricerca rimane lo studio delle influenze genetiche e ambientali legate a tali reti di connettività funzionale e del loro possibile sviluppo durante la crescita del soggetto. Negli ultimi anni è stata introdotta l'idea che l'analisi delle RSNs e delle loro caratteristiche topologiche possa essere potenzialmente utilizzata per studiare il cambiamento di connettività funzionale che si verifica nei soggetti durante lo sviluppo. In questo contesto, l'analisi dei dataset fMRI ottenuti da campioni di coppie di gemelli offre l'opportunità unica di studiare l'ereditarietà associata alle RSN, di valutare le basi genetiche delle reti funzionali cerebrali e le caratteristiche topologiche associate. L’ereditarietà indica la stima quantitativa della variazione fenotipica complessiva che è attribuibile a fattori genetici. Le stime di ereditabilità rappresentano un mezzo per definire i limiti della genetica nel prevedere una determinata malattia e determinare il rischio di un possibile effetto alle funzionalità cerebrali creata da tale malattia. Tuttavia, la parte critica dell’indagine si basa sull’analisi dell’impatto genetico e ambientale sulle RSNs e sui relativi parametri topologici. Gli studi relativi ai gemelli ci forniscono una ottima base per l’analisi dell’impatto genetico e ambientale su un determinato fenotipo, sfruttando il presupposto che i gemelli monozigoti sono caratterizzati da un genoma identico, mentre i gemelli dizigoti presentano un genoma equivalente al 50%. Lo scopo di questo lavoro di tesi è di utilizzare i metodi statistici applicati nello studio dei gemelli per studiare “in vivo” le funzioni cerebrali e approfondire l’entità degli effetti genetici e ambientali sulle caratteristiche funzionali del cervello. Dopo la pre-elaborazione e l’ottimizzazione della pulizia dell'intero dataset rs-fMRI, è stata applicata un'analisi di connettività funzionale basata su tecniche Seed-based per stimare la connettività funzionale stabilita tra regioni del cervello. In primo luogo, viene applicata la parcellizzazione dei volumi fMRI utilizzando l’atlante AAL, che permette di ottenere le regioni d’interesse (ROI) del cervello da analizzare. Le ROI che estraiamo rappresentano i nodi delle dinamiche reti cerebrali. Alla parcellizzazione dei volumi fMRI, segue l'estrazione del segnale ROI BOLD con cui otteniamo le serie temporali associate a ciascuna ROI. Le serie temporali del segnale BOLD associata a ciascuna ROI rappresentano la dinamica associata a tutti i voxel che compongono la ROI. Successivamente, abbiamo utilizzato le serie temporali del segnale BOLD estratte per ogni ROI, per ottenere le matrici di connettività funzionale della Cross-Correlation, stimata calcolando il coefficiente di correlazione lineare di Pearson tra le serie temporali di coppie di ROI, e la matrice di Mutua Informazione, ottenuta calcolando la mutua informazione (informazione condivisa) tra le serie temporali di una coppia di ROI. Queste due matrici di connettività funzionale rappresentano i parametri a livello di link tra regioni della rete cerebrale. Gli elementi della matrice indicano le connessioni di connettività funzionale tra coppie di ROI. Successivamente, sono stati estratti dalla matrice di connettività funzionale di Cross-Correlazione una serie di parametri topologici a livello di rete e a livello di nodo della rete cerebrale, per tutti i soggetti e per tutte le coppie di gemelli monozigoti (MZ) e dizigoti (DZ). È stata poi valutata la somiglianza di ciascun parametro topologico - estratto a livello di rete, nodo o collegamento (link) tra nodi - all'interno di ciascuna coppia di gemelli. Questa analisi di somiglianza è stata eseguita separatamente su coppie MZ e DZ separatamente estraendo la correlazione tra i valori del parametro topologico attraverso le coppie MZ / DZ al netto di età e sesso delle coppie. Dopo tale analisi abbiamo ottenuto una stima dei valori di correlazione intra-coppia per coppie MZ e DZ, rMZ e rDZ, che vengono utilizzati per stimare le influenze genetiche e ambientali che agiscono sul parametro topologico considerato, utilizzando modelli statistici gemellari. Sulla base del confronto tra i valori rMZ e rDZ, è stato selezionato il modello gemellare più appropriato e, se possibile, utilizzato per stimare i contributi genetici e ambientali, comprese anche le misure di ereditabilità per ciascun parametro funzionale della rete cerebrale. Il test z di Fisher è stato impiegato per valutare la significatività dell'ereditarietà a partire dalla differenza di correlazione tra coppie MZ e DZ, associata a ciascun parametro topologico. Parallelamente, abbiamo valutato i possibili effetti del sesso e dell'età sul livello di somiglianza intra-coppia dei parametri topologici, al netto dell’effetto della zigosità della coppia di gemelli. Utilizzando più modelli di regressione lineare, la differenza intra-coppia di ciascun parametro topologico è stata modellata in termini di zigosità, età e sesso. Quest'ultima analisi vuole capire se l'età e il sesso della coppia possono influenzare la differenza di ciascun parametro topologico nelle coppie gemelle. Dall'analisi di somiglianza intra-coppia, notiamo che la correlazione intra-coppia di ciascun parametro topologico tra coppie MZ risulta sempre superiore alla correlazione intra-coppia valutata tra coppie DZ. Le differenze di correlazione intra-coppia più elevate tra le coppie MZ e DZ sono state trovate associate al valore di Mutua Informazione calcolata tra ROI. Quest’ultimo risultato suggerisce l'ipotesi che la connettività funzionale tra ROI, basata su interazioni non lineari, fosse caratterizzata da un'alta influenza genetica. Per quanto riguarda l'analisi delle influenze genetiche e ambientali, non siamo stati in grado di analizzare l'effetto epistatico o applicare alcun modello statistico gemellare al parametro a livello di rete, a causa della negatività dei valori rDZ di ciascun parametro a livello di rete. La negatività dei coefficienti rDZ può essere dovuta alla ridotta dimensione del campione di analisi. Invece, gli effetti genetici creati dall’epistasi risultano essere presenti in quasi tutti i link di connettività funzionale della matrice di Mutua Informazione e di Cross-Correlazione. I link di connettività funzionale tra coppie ROI, basate su Mutua Informazione, risultano essere più adatti all'analisi genetica e ambientale basata sull'applicazione dei modelli statistici gemellari e associati ad un valore più elevato di ereditarietà, rispetto ai link di connettività funzionale della matrice di Cross-Correlazione. L'analisi genetica e ambientale viene anche applicata ai parametri nodali della rete. Per la maggior parte dei nodi che risultano adatti per cui risulta applicato un modello statistico gemellare, notiamo un'influenza dell'ambiente non condiviso superiore al 70%. Dall'analisi quantitativa sulla differenza di correlazione intra-coppia tra coppie MZ e DZ, abbiamo trovato un numero maggiore di differenze di correlazione intra-coppia significative per i nodi e per i link di connettività funzionale associati ad un effetto epistatico. Inoltre, i link di connettività funzionale basati su Mutua Informazione mostrano un numero maggiore di differenze di correlazione intra-coppia significative rispetto ai link della matrice di Cross-Correlazione. Dall'ultima analisi di correlazione relativa all'analisi dell’effetto significativo del sesso e dell'età sulla differenza intra-coppia di ciascun parametro topologico, non abbiamo ritrovato un effetto significativo dell'età o del sesso sulla differenza intra-coppia per quanto riguarda i parametri di nodali e di link. Al contrario, abbiamo visto un effetto significativo dell'età e del sesso sulla somiglianza intra-coppia dei parametri nodali della rete. Per la maggior parte dei nodi abbiamo trovato un valore di correlazione negativo tra l'età della coppia di gemelli e la differenza intra-coppia del parametro nodale. Questa correlazione negativa indica un aumento della somiglianza intra-coppia, per la maggior parte dei parametri nodali, all’aumentare dell'età della coppia di gemelli. In conclusione, questo lavoro di tesi è rivolto inizialmente all’introduzione di un nuovo metodo di pulizia dei dati fMRI, a cui sono seguite analisi di pre-elaborazione e analisi dei dati rs-fMRI ottenuti da coppie di gemelli. Abbiamo implementato un’analisi completa rivolta all’indagine quantitativa delle reti di connettività funzionale, risultate attive a livello cerebrale durante lo stato di riposo del paziente. Tale analisi è basata all'estrazione di un numero elevato di parametri a livello della globale della rete, a livello di nodo e a livello di link tra nodi. Questo lavoro di tesi è per noi un miglioramento nello studio della connettività funzionale cerebrale e un passo avanti per quanto riguarda le analisi dei parametri topologici applicati a studi di coppie di gemelli. Per concludere, riteniamo che i risultati ottenuti intendono fornire interessanti spunti sugli effetti genetici e ambientali delle reti cerebrali. Tali risultati possono avere un impatto importante nei contesti clinici, in quanto si ha a disposizione un’analisi approfondita di diversi tipi di parametri topologici della rete funzionale.