Gene expression profiling of response to treatment with lurbinectedin in a small cell lung cancer cell line

Lung cancer continues to be the leading cause of cancer-related deaths in men and women worldwide and every year it almost kills as many people as pancreas, breast, and colorectum cancer combined. Lung cancer arises from the cells of the respiratory epithelium and can be divided into two main categories: Non–Small Cell Lung Cancer (NSCLC), accounting for 85% of lung cancer cases, and Small Cell Lung Cancer (SCLC), accounting for the remaining 15% of cases. Among these types of lung tumors, SCLC is the one with the worst prognosis and the highest lethality, with a 5-year survival rate of 1-5%. SCLC belongs to the category of high-grade neuroendocrine lung tumors and it is characterized by rapid tumor growth, early metastasis, genomic instability and acquired therapeutic resistance. Unfortunately, in most cases, at the time of diagnosis the disease has already metastasized outside the lung and this contributes to its poor prognosis. Despite the availability of new diagnostic and genetic technologies, advancements in surgical techniques, and the development of new biologic treatments, no important therapeutic clinical advances have been seen in the therapy and survival of patients suffering from this devastating disease over the last 30 years. The standard-of-care, first-line therapy consists of platinum (carboplatin or cisplatin) combined with etoposide or irinotecan and this combination has remained unchanged for nearly three decades. This led, in 2012, to the classification of SCLC as a recalcitrant cancer requiring special resources and efforts. Therefore, there is an urgent, unmet clinical need to develop more effective therapies. In the last half-century, the marine environment has been widely investigated for the development of anticancer drugs, leading to the discovery of marine-derived anticancer agents that have offered new hopes in the treatment of patients affected by previously incurable types of cancer. Among these pharmaceuticals, trabectedin is a compound with an intriguing pleiotropic anticancer mechanism, affecting not only the tumor cells but also the tumor microenvironment. Trabectedin acts as a transcriptional regulator due to its ability to bind to the DNA minor groove and it is currently approved for the treatment of ovarian cancer and soft tissue sarcomas. Based on these unique features, a synthetic analogue of trabectedin called lurbinectedin was developed. Several lines of evidence demonstrated that lurbinectedin has peculiar effects against cancer cells and tumor microenvironment and these effects may be of particular interest in the treatment of tumors with transcription addiction, such as SCLC. Furthermore, in August 2018, based on the results of a number of studies demonstrating the promising clinical activity of lurbinectedin in SCLC, the U.S. Food and Drug Administration (FDA) granted lurbinectedin orphan drug status for SCLC. The present work has been developed in this framework within a collaboration between the Politecnico di Milano and the Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri and it aims to investigate the molecular mechanism underlying the antitumoral action of lurbinectedin in SCLC through bioinformatics approaches. The experiments were conducted on a SCLC cell line, called SHP-77. In order to investigate the gene expression profiles of SHP-77 cell line under lurbinectedin treatment, gene expression changes were assessed in a time-course fashion: 6, 24 and 48 hours post-treatment were compared to untreated samples. Total RNA was purified from treated and untreated samples and processed through the technique of microarrays that allows the analysis of the expression of thousands of genes simultaneously. In order to unravel the transcriptional perturbations induced by lurbinectedin treatment, we determined the most significantly modulated genes, called differentially expressed genes (DEGs), comparing each treated condition to untreated samples. After 6 hours of treatment only 89 genes were found to be differentially expressed, of which 31 up-regulated and 58 downregulated, whereas there was a dramatic change in gene expression profiles after 24 hours (4529 DEGs of which 1982 up-regulated and 2547 down-regulated) and 48 hours (5457 DEGs of which 2368 up-regulated and 3089 down-regulated) of drug exposure. Therefore, as the duration of treatment increases the amount of transcriptional perturbations induced by lurbinectedin increases. As genes are not independent biological entities, DEGs can be read in a context of biological signaling pathways that represent a useful information on the mechanisms that cells are undergoing under specific conditions. In order to achieve a clearer understanding of the biological functions of the previously identified DEGs, we performed a topology-based pathway analysis by analyzing signaling pathways impacted by the observed changes. Our findings indicate that lurbinectedin treatment results in the inhibition of several signaling pathways, most of which are known to be abnormally regulated in SCLC or other human tumors, such as MAPK, mTOR, WNT and EGFR signaling pathways. Thus, these preliminary results set lurbinectedin in a context of promising drug treatment. There is a strong evidence that ASCL1, a neuronal differentiation regulator, is the key transcriptional driver in most of human SCLCs. ASCL1 regulates stemness, cell cycle progression and mitosis; it is essential for SCLC cell lines survival and also required for tumor development in genetically engineered mouse models. Furthermore, it was proven that downregulation of ASCL1 gene expression causes growth inhibition and apoptosis in SCLC, providing further support for its role as promising therapeutic target in this type of lung cancer. Hence, given the pivotal role played by ASCL1 transcription factor in SCLC pathogenesis, we investigated whether lurbinectedin treatment modulates ASCL1 expression. We reported evidence that lurbinectedin is effective in strongly down-regulating ASCL1 expression after 24 hours (logFC = -2.4) and 48 hours (logFC = -2.8) of treatment. This result was also confirmed by RT-PCR and Western Blot. Hence, this finding emphasizes the hopeful role that lurbinectedin may have in SCLC treatment. Since lurbinectedin is a transcriptional regulator, we evaluated whether other transcription factors may be affected by drug treatment. A widely used approach to characterize the functional status of transcriptional regulatory circuits is based on the prediction of transcription factors activities from the mRNA levels of their targets. Hence, to predict transcription factors activities in treated and untreated samples, we first reversed engineer a SCLC-specific transcriptional network starting from a clinical dataset of 81 SCLC patients and the collection of all known transcription factors. We made use of an information theoretic algorithm based on mutual information to compute significant associations between a transcription factor and all candidate targets, deriving a regulatory unit for each transcription factor, which is defined as regulon. Then, we performed a virtual protein activity analysis to investigate the activity of in silico inferred regulons. However, a regulator may appear to be significantly activated simply because several of its targets may also be regulated by a bona fide activated transcription factor. This phenomenon is known as shadow effect and, since transcriptional regulation is highly pleiotropic, this can lead to false positive results. In this work, in order to avoid false positive results, shadow analysis was performed for all regulators. We identified 23 regulons affected by lurbinectedin treatment, of which 9 were repressed and 14 activated. Repressed regulons after lurbinectedin treatment are CHD6, MLL, MLL3, PLXNA1, YEATS4, ZBTB11, PHF21A, NR0B2 and ASCL1. On the other hand, activated regulons after lurbinectedin treatment are RELB, SP110, CCDC71, EDF1, ZFP36L2, STAT1, KLF2, IRF1, JUNB, STAT5A, PARP12, NFKB2, BATF2 and IRF9. It is worth emphasizing the inhibition of ASCL1 regulon after 24 and 48 hours of treatment: this indicates that lurbinectedin effectively down-regulates not only ASCL1 gene but also its regulatory network. Gene Ontology (GO) enrichment analysis was carried out on activated and inhibited regulons independently to identify the biological regulatory functions related to these regulons. We found that suppressed regulons after treatment are mainly involved in transcription, protein synthesis and neural functions. On the other hand, activated regulons are mainly related to immune responses. In the second part of the study, we analyzed gene expression data from a cohort of human SCLC tumors in comparison to a set of healthy lung samples in order to unravel transcriptional programs with a deregulated activity in human SCLC compared to physiological condition. Then, these results were integrated with those obtained from SHP-77 cell line analysis in order to identify SCLC-specific transcriptional alterations that might be targeted by lurbinectedin treatment. We identified a number of regulons with altered activity in human SCLC compared to physiological condition. Consistently with the existing literature, we found that activated regulons in human SCLC are mainly involved in mitosis, mitochondrial activities, protein synthesis, energetic metabolism and neural functions. On the other hand, repressed regulons are mainly involved in immune responses. Then, integrating this result with SHP-77 cell line data, we demonstrated that lurbinectedin may be able to target a number of these regulons. In particular, the two regulons with the highest activity in human SCLC, namely PHF21A and ASCL1, are strongly down-regulated in SHP-77 cell line following lurbinectedin treatment. The other regulons with abnormal activity in human SCLC and down-regulated after treatment are CHD6, PLXNA1, MLL and ZBTB11. On the other hand, among the repressed regulons in human SCLC there are JUNB and KLF2, which are up-regulated following lurbinectedin treatment. In the third part of the project, SHP-77 cell line transcriptomic data were complemented with methylation data available from the National Center for Biotechnology Information-Gene Expression Omnibus (NCBI-GEO). It has been demonstrated that lurbinectedin binds specifically to CG-rich sequences located in the proximity of promoters of protein-coding genes and some of these sequences may be related to the regulation of gene expression by constituting CpG islands. Hence, we investigated whether in SHP-77 cell line lurbinectedin treatment results in the modulation of genes associated with methylated or unmethylated CpG islands at basal condition. Our results indicate that lurbinectedin seems to act on a number of genes associated with methylated and unmethylated CpG islands at basal condition. In particular, we identified a group of genes associated with unmethylated CpG islands at basal condition and downregulated after lurbinectedin treatment. Pathway enrichment analysis revealed that these genes are associated with some pathways known to be activated in SCLC, such as MAPK, axon guidance and mTOR signaling pathway. Furthermore, given the interesting role played by BCL2 oncogene in SCLC, we investigated whether it is modulated by lurbinectedin. It is known that BCL2 is one of the most differentially methylated genes in SCLC in comparison to normal lung: indeed, this gene is methylated and silenced in normal lung, whereas it is overexpressed in SCLC and its upregulation may be driven primarily by epigenetic mechanisms. BCL2 is an anti-apoptotic gene that prevents cells from undergoing apoptosis and it is considered an intriguing target for intervening in tumor development. We found that, in SHP-77 cell line, BCL2 is associated with unmethylated CpG islands at basal condition and we reported evidence that lurbinectedin could be effective in inhibiting BCL2 expression, which appears as a promising therapeutic strategy. Finally, given the novelty of the drug lurbinectedin, we investigated whether it shared a similar effect on transcriptomic profile as other known drugs. To this aim, we queried the popular Connectivity Map (CMAP) to search for gene expression profiles related to the treatment with different known drugs that show a high affinity to that of SHP-77 treated with lurbinectedin, starting from the altered regulons in human SCLC and modulated by lurbinectedin. We identified a number of drugs with interesting features that show a high degree of correlation with lurbinectedin. First, we found that lurbinectedin, as trabectedin, has a high correlation with topoisomerase I inhibitors, in particular irinotecan and camptothecin. As these drugs are currently used in first- and second-line treatment for SCLC, our findings provide a rational for further investigate the combination of lurbinectedin and these drugs to obtain synergistic antitumor effects. Then, another intriguing finding is the high correlation between lurbinectedin and daunorubicin: this drug works in part by inhibiting DNA topoisomerase II activity and it is used in the treatment of neuroblastoma, that is a neuroendocrine tumor as well as SCLC. Among the other drugs that have shown the highest correlation with lurbinectedin there is phenoxybenzamine, a noncompetitive antagonist of α1- and α2-adrenergic receptors, that has previously shown a high degree of correlation also with trabectedin. In conclusion, this study shed light on the mechanism of action of lurbinectedin in SCLC demonstrating that this drug might be effective in targeting SCLC-specific transcriptional features. First, we reported evidence that lurbinectedin may have an inhibitory effect on a multitude of biological signaling pathways, most of which are known to have an abnormal activity in SCLC or other human tumors. Then, we demonstrated that lurbinectedin might be effective in modulating a number of SCLC-specific transcriptional targets. In particular, it is worth emphasizing the down-regulation of ASCL1 regulatory unit after treatment. Furthermore, this drug might be effective in inhibiting the expression of BCL2 oncogene, that is considered a promising therapeutic target in SCLC. Finally, we identified a number of drugs that show a high degree of correlation with lurbinectedin: among these pharmaceuticals, we highlight the high correlation with topoisomerase I inhibitors, a feature that was previously reported also for trabectedin. This finding is intriguing since, as topoisomerase I inhibitors are currently used for SCLC treatment, we identified a potential synergism between lurbinectedin and these drugs that could be exploited to develop less toxic and more effective therapies. This work has been developed using different bioinformatics approaches and it represents a strong base for further investigations. Certainly, there are also limitations. The major drawback of our study is the use of a single cell line: indeed, more cell line models are needed to confirm our results and to shift on preclinical models. Moreover, although microarrays are an old technology, these preliminary results can pave the way for deeper investigation through high-throughput sequencing approaches.

Il cancro polmonare continua ad essere la principale causa di morte per tumore in entrambi i sessi in tutto il mondo ed ogni anno uccide quasi tante persone quante ne vengono uccise dal tumore al pancreas, al seno e al colon-retto considerati complessivamente. Il tumore polmonare ha origine dalle cellule dell’epitelio respiratorio e può essere classificato in due categorie principali: tumore polmonare non a piccole cellule (NSCLC), che rappresenta circa l’85% dei casi di tumore al polmone, e tumore polmonare a piccole cellule (SCLC), che rappresenta il restante 15%. Tra queste tipologie di tumore polmonare, SCLC presenta la prognosi peggiore e la più alta letalità, con un tasso di sopravvivenza a cinque anni di circa 1-5%. SCLC appartiene alla categoria dei tumori polmonari neuroendocrini di alto grado ed è caratterizzato da una rapida crescita tumorale, metastasi precoci, instabilità genomica e resistenza terapeutica acquisita. Sfortunatamente, nella maggioranza dei casi, al momento della diagnosi la patologia presenta già metastasi al di fuori del polmone e questo contribuisce alla prognosi sfavorevole. Nonostante la disponibilità di nuove tecnologie diagnostiche e genetiche, miglioramenti delle tecniche chirurgiche, e lo sviluppo di nuovi trattamenti biologici, negli ultimi 30 anni non ci sono stati importanti miglioramenti clinico-terapeutici nella terapia e nella sopravvivenza dei pazienti affetti da questa patologia devastante. La terapia standard di prima linea consiste in una combinazione di platino (carboplatino o cisplatino) con etoposide o irinotecano e tale combinazione è rimasta invariata per quasi tre decadi. Questo ha portato, nel 2012, alla classificazione di SCLC come tumore recalcitrante che necessita di risorse e sforzi speciali. Dunque, vi è un bisogno clinico urgente e insoddisfatto di sviluppare terapie più efficaci. Nell’ultimo mezzo secolo, l’ambiente marino è stato ampiamente studiato per lo sviluppo di farmaci, portando alla scoperta di agenti antitumorali di origine marina che hanno offerto nuove speranze nel trattamento di pazienti affetti da tipologie tumorali precedentemente incurabili. Tra questi farmaci, la trabectedina è un composto con un intrigante meccanismo antitumorale pleiotropico, che colpisce non solo le cellule tumorali ma anche il microambiente tumorale. La trabectedina agisce come regolatore trascrizionale grazie alla sua capacità di legarsi al solco minore del DNA e, al giorno d’oggi, è approvata per il trattamento del tumore ovarico e dei sarcomi dei tessuti molli. In base a queste caratteristiche uniche, è stato sviluppato un analogo sintetico della trabectedina chiamato lurbinectedina. È stato ampiamente dimostrato che la lurbinectedina ha effetti peculiari contro le cellule tumorali e il microambiente tumorale e questi effetti potrebbero essere di particolare interesse nel trattamento di tumori con dipendenza da trascrizione, come SCLC. Inoltre, nell’agosto 2018, sulla base dei risultati di molteplici studi che dimostrano la promettente attività clinica della lurbinectedina in SCLC, la U.S. Food and Drug Administration (FDA) ha concesso la designazione di farmaco orfano alla lurbinectedina per il trattamento di SCLC. Il presente lavoro è stato sviluppato in questo contesto nell’ambito di una collaborazione tra il Politecnico di Milano e l’Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri e ha l’obiettivo di indagare il meccanismo molecolare alla base dell'azione antitumorale della lurbinectedina in SCLC attraverso approcci bioinformatici. Gli esperimenti sono stati condotti su una linea cellulare di SCLC, chiamata SHP-77. Al fine di studiare i profili di espressione della linea cellulare SHP-77 trattata con lurbinectedina, i cambiamenti di espressione genica sono stati valutati mediante una analisi di tipo time-course: i campioni trattati a 6, 24 e 48 ore sono stati confrontati con i campioni non trattati. L’RNA totale è stato purificato dai campioni trattati e non trattati ed è stato processato attraverso la tecnica dei microarray che permette l’analisi simultanea dell’espressione di migliaia di geni. Al fine di rivelare le perturbazioni trascrizionali indotte dal trattamento con lurbinectedina, abbiamo determinato i geni modulati in modo più significativo, chiamati geni differenzialmente espressi, confrontando ogni condizione trattata con i campioni non trattati. Dopo 6 ore di trattamento, solamente 89 geni sono stati identificati come differenzialmente espressi, di cui 31 sovra-espressi e 58 sotto-espressi; invece, è stato registrato un notevole cambiamento nei profili di espressione genica dopo 24 ore (4529 geni differenzialmente espressi, di cui 1982 sovraespressi e 3089 sotto-espressi) e 48 ore (5457 geni differenzialmente espressi di cui 2368 sovraespressi e 3089 sotto-espressi) di esposizione al farmaco. Pertanto, all’aumentare della durata del trattamento le perturbazioni trascrizionali indotte dalla lurbinectedina aumentano. Dato che i geni non sono entità biologiche indipendenti, i geni differenzialmente espressi possono essere letti in un contesto di pathway biologici che forniscono informazioni sui meccanismi a cui le cellule stanno andando incontro in specifiche condizioni. Al fine di raggiungere una conoscenza più chiara delle funzioni biologiche dei geni differenzialmente espressi precedentemente identificati, abbiamo eseguito una analisi topologica dei pathway identificando i pathway che vengono influenzati dai cambiamenti osservati. I nostri risultati indicano che il trattamento con lurbinectedina provoca l’inibizione di diversi pathway, la maggior parte dei quali sono noti per essere regolati in modo anormale in SCLC o in altri tumori umani, come i pathway di MAPK, mTOR, WNT e EGFR. Dunque, questi risultati preliminari inseriscono la lurbinectedina in un contesto di trattamento farmacologico promettente. Vi è una forte evidenza che ASCL1, un regolatore della differenziazione neuronale, sia il driver trascrizionale chiave nella maggioranza dei casi di SCLC. ASCL1 regola la staminalità, la progressione del ciclo cellulare e la mitosi; è essenziale per la sopravvivenza di linee cellulari di SCLC ed è anche necessario per lo sviluppo del tumore in modelli di topo geneticamente modificati. Inoltre, è stato dimostrato che la down-regolazione dell’espressione genica di ASCL1 comporta l’inibizione della crescita e l’apoptosi in SCLC, fornendo ulteriore sostegno al suo ruolo di bersaglio terapeutico promettente in questo tipo di tumore polmonare. Dunque, dato il ruolo fondamentale svolto dal fattore di trascrizione ASCL1 nella patogenesi di SCLC, ci siamo chiesti se il trattamento con lurbinectedina modulasse l’espressione di ASCL1. Abbiamo dimostrato che la lurbinectedina down-regola fortemente l’espressione di ASCL1 dopo 24 (logFC = -2.4) e 48 (logFC = -2.8) ore di trattamento. Questo risultato è stato confermato anche con RT-PCR e Western Blot. Dunque, tale risultato sottolinea il ruolo promettente che la lurbinectedina potrebbe avere nel trattamento di SCLC. Dato che la lurbinectedina è un regolatore trascrizionale, abbiamo valutato se altri fattori di trascrizione potessero essere modulati dal trattamento farmacologico. Un approccio ampiamente utilizzato per caratterizzare lo stato funzionale dei circuiti regolatori trascrizionali si basa sulla previsione delle attività dei fattori di trascrizione dai livelli di mRNA dei loro target. Dunque, al fine di predire le attività dei fattori di trascrizione nei campioni trattati e non trattati, abbiamo innanzitutto ricostruito una rete trascrizionale specifica per SCLC a partire da un dataset clinico di 81 pazienti affetti da SCLC e dalla collezione di tutti i fattori di trascrizione noti. Abbiamo utilizzato un algoritmo teorico di informazione basato sulla mutua informazione per calcolare le associazioni significative tra un fattore di trascrizione e tutti i possibili target, derivando un’unità regolatoria per ciascun fattore di trascrizione che viene definita come regulon. Successivamente, abbiamo eseguito una analisi virtuale dell’attività proteica per studiare l’attività dei regulon ricostruiti in silico. Tuttavia, un regolatore potrebbe apparire come significativamente attivato semplicemente perché molti dei suoi target potrebbero essere regolati anche da un fattore di trascrizione autenticamente attivato. Questo fenomeno è conosciuto come effetto ombra e, dato che la regolazione trascrizionale è altamente pleiotropica, può portare a falsi positivi. In questo lavoro, al fine di evitare falsi positivi, l’analisi delle ombre è stata eseguita per tutti i regolatori. Abbiamo identificato 23 regulon influenzati dal trattamento con lurbinectedina, di cui 9 repressi e 14 attivati. I regulon repressi dopo il trattamento con lurbinectedina sono CHD6, MLL, MLL3, PLXNA1, YEATS4, ZBTB11, PHF21A, NR0B2 e ASCL1. Dall’altra parte, i regulon attivati dopo il trattamento con lurbinectedina sono RELB, SP110, CCDC71, EDF1, ZFP36L2, STAT1, KLF2, IRF1, JUNB, STAT5A, PARP12, NFKB2, BATF2 e IRF9. Vale la pena sottolineare l’inibizione del regulon di ASCL1 dopo 24 e 48 ore di trattamento: questo indica che la lurbinectedina down-regola efficacemente non solo il gene ASCL1 ma anche la sua rete regolatoria. L’analisi di arricchimento Gene Ontology (GO) è stata effettuata indipendentemente sui regulon attivati e inibiti per identificare le funzioni biologiche di regolazione associate a questi regulon. Abbiamo trovato che i regulon soppressi dopo il trattamento sono principalmente coinvolti nella trascrizione, nella sintesi delle proteine e nelle funzioni neurali. Dall’altra parte, i regulon attivati sono principalmente correlati alle risposte immunitarie. Nella seconda parte dello studio, abbiamo analizzato i dati di espressione genica provenienti da una coorte di tumori umani di SCLC confrontati con un set di campioni di polmone sano allo scopo di individuare i programmi trascrizionali che presentano una attività deregolata nello SCLC umano in confronto alla condizione fisiologica. Successivamente, questi risultati sono stati integrati con quelli ottenuti dalla analisi sulla linea cellulare SHP-77 al fine di identificare le alterazioni trascrizionali specifiche di SCLC che potrebbero essere bersagliate dal trattamento con lurbinectedina. Abbiamo identificato un numero di regulon con attività alterata nello SCLC umano in confronto alla condizione fisiologica. Coerentemente con la letteratura esistente, abbiamo trovato che i regulon attivati nello SCLC sono principalmente coinvolti nella mitosi, nelle attività mitocondriali, nella sintesi delle proteine, nel metabolismo energetico e nelle funzioni neurali. Dall’altra parte, i regulon repressi sono principalmente coinvolti nelle risposte immunitarie. Infine, integrando questo risultato con i dati della linea cellulare SHP-77, abbiamo dimostrato che la lurbinectedina potrebbe essere in grado di bersagliare un certo numero di questi regulon. In particolare, i due regulon con la più alta attività nello SCLC, ovvero PHF21A e ASCL1, sono fortemente down-regolati nella linea cellulare SHP-77 a seguito del trattamento con lurbinectedina. Gli altri regulon che presentano una attività anormale nello SCLC e che vengono down-regolati dopo il trattamento sono CHD6, PLXNA1, MLL e ZBTB11. Dall’altra parte, tra i regulon repressi nello SCLC ci sono JUNB e KLF2, i quali vengono up-regolati a seguito del trattamento con lurbinectedina. Nella terza parte del progetto, i dati di trascrittomica della linea cellulare SHP-77 sono stati complementati con dati di metilazione disponibili dal National Center for Biotechnology Information-Gene Expression Omnibus (NCBI-GEO). È stato dimostrato che la lurbinectedina si lega in modo specifico alle sequenze ricche di CG localizzate in prossimità dei promotori di geni codificanti e alcune di queste sequenze potrebbero essere correlate alla regolazione dell’espressione genica costituendo delle CpG islands. Pertanto, ci siamo chiesti se, nella linea cellulare SHP-77, il trattamento con lurbinectedina comportasse la modulazione di geni associati a CpG islands metilate o non metilate alla condizione basale. I nostri risultati indicano che la lurbinectedina sembra agire su un numero di geni associati a CpG islands metilate e non metilate alla condizione basale. In particolare, abbiamo identificato un gruppo di geni associati a CpG islands non metilate alla condizione basale e down-regolati dopo il trattamento con lurbinectedina. L’analisi di arricchimento dei pathway ha rivelato che questi geni sono associati ad alcuni pathway noti per essere attivati nello SCLC, come i pathway di MAPK, mTOR e axon guidance. Inoltre, dato l'interessante ruolo svolto dall'oncogene BCL2 nello SCLC, ci siamo chiesti se questo venisse modulato dalla lurbinectedina. È noto che BCL2 è uno dei geni più differenzialmente metilati nello SCLC in confronto al polmone sano: infatti, questo gene è metilato e silenziato nel polmone sano, mentre è sovra-espresso nello SCLC e la sua sovraespressione potrebbe essere guidata principalmente da meccanismi epigenetici. BCL2 è un gene anti-apoptotico che impedisce l’apoptosi delle cellule ed è considerato un target intrigante per intervenire nello sviluppo del tumore. Abbiamo trovato che, nella linea cellulare SHP-77, BCL2 è associato a CpG islands non metilate alla condizione basale e abbiamo dimostrato che la lurbinectedina potrebbe essere efficace nell’inibire l’espressione di BCL2, che appare come una strategia terapeutica promettente. In ultima istanza, data la novità del farmaco lurbinectedina, abbiamo indagato se il suo effetto sul profilo trascrittomico fosse condiviso da altri farmaci noti. A tale scopo, abbiamo utilizzato la popolare Connectivity Map (CMAP) per cercare profili di espressione relativi al trattamento con farmaci già noti che mostrassero un’alta affinità al profilo di espressione della SHP-77 trattata con lurbinectedina, partendo dai regulon alterati nello SCLC umano e modulati dal farmaco. Abbiamo identificato un certo numero di farmaci con caratteristiche interessanti che mostrano un alto grado di correlazione con la lurbinectedina. Innanzitutto, abbiamo trovato che la lurbinectedina, come la trabectedina, presenta un’alta correlazione con gli inibitori delle topoisomerasi I, in particolare con irinotecano e camptotecina. Dato che questi farmaci vengono correntemente utilizzati nel trattamento di prima e seconda linea per SCLC, i nostri risultati forniscono un razionale per indagare ulteriormente la combinazione di lurbinectedina e questi farmaci al fine di ottenere effetti antitumorali sinergici. Un altro risultato interessante è l’alta correlazione trovata tra la lurbinectedina e la daunorubicina: questo farmaco lavora in parte inibendo l’attività della DNA topoisomerasi II ed è utilizzato nel trattamento del neuroblastoma, che è un tumore neuroendocrino proprio come SCLC. Tra gli altri farmaci che hanno mostrato la più alta correlazione con la lurbinectedina vi è la fenossibenzamina, un antagonista non competitivo dei recettori adrenergici α1 e α2, che ha precedentemente mostrato un alto grado di correlazione anche con la trabectedina. In conclusione, questo studio ha messo luce sul meccanismo di azione della lurbinectedina nello SCLC dimostrando che questo farmaco potrebbe essere efficace nel bersagliare delle caratteristiche trascrizionali specifiche di questa patologia. Innanzitutto, abbiamo evidenziato che la lurbinectedina potrebbe avere un effetto inibitorio su una moltitudine di pathway biologici, la maggioranza dei quali sono noti per avere una attività anormale in SCLC o in altri tumori umani. Successivamente, abbiamo dimostrato che la lurbinectedina potrebbe essere efficace nel modulare un certo numero di target trascrizionali specifici di SCLC. In particolare, vale la pena sottolineare la down-regolazione della unità regolatoria di ASCL1 a seguito del trattamento. Inoltre, questo farmaco potrebbe essere efficace nell’inibire l’espressione dell’oncogene BCL2, che è considerato un target terapeutico promettente in SCLC. Infine, abbiamo individuato alcuni farmaci che mostrano un alto grado di correlazione con la lurbinectedina: tra questi sottolineiamo l’alta correlazione con gli inibitori di topoisomerasi I, caratteristica che è stata precedentemente riportata anche per la trabectedina. Questo risultato è affascinante poiché, dal momento che gli inibitori di topoisomerasi I sono correntemente utilizzati per il trattamento di SCLC, abbiamo identificato un potenziale sinergismo tra la lurbinectedina e questi farmaci che potrebbe essere sfruttato per sviluppare terapie meno tossiche e più efficaci. Questo lavoro è stato realizzato utilizzando diversi approcci bioinformatici e rappresenta una base solida per ulteriori indagini. Certamente sono presenti anche dei limiti. Il difetto principale del nostro studio è l'utilizzo di una sola linea cellulare: infatti, sono necessari più modelli di linea cellulare per confermare i nostri risultati e per passare a modelli preclinici. Inoltre, sebbene i microarray siano una tecnologia ormai obsoleta, questi risultati preliminari possono aprire la strada a indagini più approfondite attraverso approcci di sequenziamento ad alta produttività.