Amphiphilic azobenzenes as neuronal photoregulators for retinopathies : role of the environment

The discovery of innovative and increasingly advanced materials is a resource today in the field of medical engineering. The possible treatment of specific pathologies through the use of photochromic molecules is an example of this and is an important incentive for the advancement of scientific research. The following thesis is aimed at the synthesis of azobenzene derivatives for the treatment of eye diseases in which retinal deterioration dramatically compromises the photoreceptive ability of the visual apparatus. Reference is made to diseases such as Age-related Macular Degeneration and Retinitis Pigmentosa, well known worldwide as they afflict over 1 million people a year. The active research fields are many and range from the insertion of bionic implants to the administration of stem cells to the most modern and sophisticated techniques of optogenetic pharmacology. The common goal of these therapies is to increase the compromised photosensitivity of the retinal cells. With reference to optogenetic pharmacology, several materials have been taken into account and the positive response obtained from a specific class of molecules, the azobenzene derivatives, led our attention to be focused on it. In fact, the azobenzene derivatives possess all the features necessary for biocompatibility with the human body, such as visible photoisomerization and reduced isomerization temperature ranges. The thesis refers in particular to the compound 1- {6 - [(4- {2- [4- (azepan-1-yl) phenyl] diazen-1-yl} phenyl) [6- (pyridin-1-ium -1-yl) hexyl] amino] hexyl} pyridin-1-ium dibromide called Ziapin 2. The characterization carried out in recent years on this amphiphilic compound has allowed us to determine its peculiar properties. It has been demonstrated that the photoisomerization of Ziapin 2 induces a change in the membrane thickness and, consequently, in its capacity. The electro-physical variation due to the photoisomerization of injected Ziapin 2 results in an actual change in the behavior of the neurons whose signal registers an increase in intensity. The further synthetization of Ziapin 2 carried out during the thesis is aimed at analyzing the behavior of the molecule in various solvents. The Ziapin 2, in fact, does not respond identically within the different environments and the photoisomerization in aqueous ones seems to be compromised by aggregation phenomena. The analyzes carried out through UV-vis absorption and PL emission spectra concerning Ziapin 2 in the various solvents allow a clear comparison on the different chemical-physical phenomena that come into play; electrophysiology studies, on the other hand, are focused at confirming the correspondence between the increase in neuronal signal due to the variation in capacity with the absorption of light by the Ziapin 2, concluding that the two events are coincident. Based on the results obtained, it was decided to continue with the characterization of other azobenzene derivatives, similar to Ziapin 2. The synthesized molecules, the Aze-Pyridinium (APn), the Aze-Amino (AAn) ed i and cross compunds, showed an analogous behavior, i.e. the photoisomerization process is inhibited when the molecules are solvated by water. The aggregative phenomena linked to the formation of excimers in fact favor a different photo-physical path. Even in this case, however, the analysis of the UV-vis absorption and photoluminescence (PL) spectra into artificial membranes confirms a recovery of the photoisomerization ability by the synthesized molecules. Further electrophysiology studies made it possible to attribute the increase in signal recorded at the membrane level to the photoisomerization of the molecules.

La scoperta di materiali innovativi e sempre più avanzati costituisce un’odierna risorsa nel campo dell’ingegneria medica. Il possibile trattamento di determinate patologie attraverso l’impiego di molecole fotocromiche ne costituisce un esempio ed un incentivo importante per l’avanzamento della ricerca scientifica. La seguente tesi è mirata alla sintetizzazione di derivati azobenzenici per il trattamento specifico di patologie oculistiche in cui il deterioramento retinale compromette drammaticamente la capacità fotoricettiva dell’apparato visivo. Viene fatto riferimento a malattie come degenerazione maculare legata all’età e retinitis pigmentosa, ben note nel panorama mondiale poiché affliggono oltre 1 milione di persone l’anno. I campi di ricerca attivi sono molteplici e spaziano dall’inserimento di impianti bionici alla somministrazione di cellule staminali fino alle più moderne e sofisticate tecniche di farmacologia optogenetica. L’obiettivo comune di queste terapie è incrementare la fotosensibilità compromessa delle cellule retinali. Con riferimento alla farmacologia optogenetica numerosi materiali sono stati presi in considerazione e la favorevole risposta ottenuta da una specifica classe di molecole, gli azocomposti, ha fatto sì che la nostra attenzione si focalizzasse verso di essa. Gli azocomposti posseggono infatti tutti i requisiti necessari affinché vi sia biocompatibilità con il corpo umano, quali fotoisomerizzazione nel visibile e ridotti intervalli di temperature di isomerizzazione. Nella tesi ci si riferisce in particolare al composto 1-{6-[(4-{2-[4-(azepan-1-yl) phenyl]diazen-1-yl}phenyl)[6- (pyridin-1-ium-1-yl) hexyl] amino] hexyl} pyridin-1-ium dibromide denominato Ziapin 2. La caratterizzazione effettuata negli ultimi anni su questo composto anfifilico ha permesso la determinazione delle proprietà peculiari del suddetto. È stato dimostrato come la fotoisomerizzazione della Ziapin 2 induca un cambiamento dello spessore di membrana e, conseguentemente, della sua capacità. La variazione elettro-fisica dovuta alla fotoisomerizzazione di Ziapin 2 iniettata si traduce in un effettivo cambio di comportamento dei neuroni il cui segnale registra un aumento di intensità. L’ulteriore sintetizzazione di Ziapin 2 svolta durante la tesi è mirata all’analisi del comportamento della molecola in vari solventi. La Ziapin 2, infatti, non risponde in modo identico all’interno dei vari ambienti e la fotoisomerizzazione in ambienti acquosi sembra essere compromessa da fenomeni aggregativi. Le analisi condotte attraverso spettri di assorbimento UV-vis e di emissione PL riguardanti la Ziapin 2 nei vari solventi permettono un paragone chiaro sui diversi fenomeni chimico-fisici che entrano in gioco; studi di elettrofisiologia, invece, sono mirati a confermare la corrispondenza tra l’aumento di segnale neuronale dovuto alla variazione di capacità con l’assorbimento di luce da parte della Ziapin 2, concludendo che i due eventi sono coincidenti. Sulla base dei risultati ottenuti è stato deciso di proseguire con la caratterizzazione di altri azocomposti, analoghi alla Ziapin 2. Le molecole sintetizzate, gli Aze-Piridinio (APn), gli Aze-Amino (AAn) ed i composti cross, hanno mostrato un comportamento simile, cioè il processo di fotoisomerizzazione risulta inibito quando le molecole vengono solvatate dall’acqua. I fenomeni aggregativi legati alla formazione di eccimeri favoriscono infatti un percorso foto-fisico differente. Anche in tal caso, però, l’analisi degli spettri di assorbimento UV-vis e di fotoluminescenza (PL) in membrane artificiali conferma un recupero dell’abilità di fotoisomerizzazione da parte delle molecole sintetizzate. Ulteriori studi di elettrofisiologia hanno permesso di imputare alla fotoisomerizzazione delle molecole l’aumento di segnale registrato a livello di membrana.