Development of fluorinated probes for cell tracking by 19F-MRI

A fundamental branch of regenerative medicine is based on the use of selected cells able to promote a therapeutic effect once transplanted into the patient’s body. These therapeutic cells are generally either stem cells or pluripotent cells or immune cells. Despite the incredible results obtained in preclinical trials, in fact over 6000 registered clinical studies have been done with approval from the major international certification institutes (FDA and EMA), their application is still far from being common and limited due to their long-term effects and toxicity risks, also related to off-target distributions of these cells. Thus, a non-invasive imaging technique able to localize cells distribution could be a key tool to support the development of such therapeutic approach. To track cells, different labelling systems have been developed for various imaging techniques. Bioluminescence (BLI), fluorescence (FLI) or photoacoustic imaging (PAI) have proven to have a great potentiality in preclinical studies but, due to their limited depth penetration in the soft tissues, are not adapted for clinical studies. PET and SPECT imaging, based on the use of radionuclides, are efficient in terms of penetration, but their low spatial resolution, short half-life, lack of detection of anatomical images and necessity to expose patients to ionizing radiations limited the development of these systems for cell tracking. MRI proved to be the most promising tool as anatomical and functional data could be obtained without depth penetration limits and the use of radio-active contrast agents. However, MRI sensibility is limited. For cell labelling, conventional available MRI contrast agents, as gadolinium-chelates and superparamagnetic nanoparticles, have been widely investigated but showing several limitations due to toxicity and non-specific signal detection. In the last decade, 19F-MRI has been proposed as a complementary technique to 1H-MRI, for in vivo cell tracking since the lack of organic fluorine in soft tissues labelled cells are specifically detected without background signal. To improve 19F-MRI sensibility, highly fluorinated molecules, i.e. perfluorocarbons, are essential to reach sufficiently high concentrations of 19F within cells. Perfluorocarbons such as PFPE, PFOB and PFCE were mainly investigated for cell labeling. More recently, a superfluorinated molecule called PERFECTA has been successfully used as a sensitive 19F-MRI probe and was chosen in the present thesis work. PERFECTA is easily synthesized in high amounts, well tolerated by cells and the presence of 36 equivalent fluorine atoms provide a single and sharp signal in 19F-MRI. To enable cell labeling, PERFECTA must be formulated either in an emulsion or in a NP to be dispersed in an aqueous solution in order to be applied in a cellular environment. Emulsions, based on the stabilization of fluorinated compounds with polymers and lipids, were initially developed and, although these systems are subject to colloidal instability, they are still widely used, especially in preclinical research. Recently, PLGA nanoparticles containing a perfluorocarbon core and stabilized with biocompatible surfactants have acquired interests thanks to their biocompatibility and biodegradability as well as for their modular structure making the formulation easily adaptable to specific needs. For these reasons, PLGA has been chosen as carrier for PERFECTA in the present thesis work. For the stabilization of PLGA nanoparticles, a zwitterionic surfactant (polyvinyl alcohol, PVA) or an ionic surfactant (sodium cholate, NaC) were both evaluated for their potential impact on cell labelling efficiency. Four different formulations, PLGA-H-PVA, PLGA-H-NaC, PLGA-PVA and PLGA-NaC, using the above mentioned surfactants and two PLGA polymers differently functionalized, were developed and chemically characterized by Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR), 19F nuclear magnetic resonance, (19F-NMR) and their colloidal stability was analysed by dynamic light scattering (DLS), nanoparticle tracking analysis (NTA) and zeta potential measurement. Following the optimization of these formulations to obtain stable NP with a high encapsulation of PERFECTA, NPs were used to label murine microglial cells (BV-2) to study their cytocompatibility and labeling efficiency through analysis performed with 19F-MRI. A first protocol was developed and optimized on PLGA-NaC NPs and subsequently adapted to the other proposed formulations. The analysis with FTIR confirmed the composition of the NPs and the encapsulation of PERFECTA inside PLGA nanoparticles without the use of fluorinated solvents. The 19F-NMR also demonstrated that no chemical change of PERFECTA occurred during NPs formulation. The formulation optimization allowed to improve nanoparticles stability in the aqueous environment up to two weeks and to achieve a high encapsulation efficiency to label cells suitable for MRI sensibility. All the formulation stabilized with either NaC and PVA, used for in vitro labelling experiments, have a PDI values lower than 0.2 and a size of approximately 100 nm and 200 nm, respectively, and confirmed by NTA measurements. Zeta-potential measurements showed a steric stabilization of PVA, for which a weak negative charge of - 5 mV was measured, and an electrostatic stabilization was obtained with NaC, with a superficial charge of about - 40 mV. The 19F-NMR analysis confirmed the concentration of fluorine atoms between 1.39x1020 and 2.96x1020 19F/ml, corresponding to an encapsulation efficiency between 22% and 46%. With these formulations, cells could be incubated with a suitable concentration 1x1014 19F/cell. Following 4 hours of incubation, an excellent cell’s viability was obtained (85% - 98%) almost similar to normal conditions (93% - 95%). The same cells were subsequently fixed and observed in MRI showing a higher cellular uptake with PLGA-H-NaC NPs compared to PLGA-H-PVA, PLGA-PVA and PLGA-NaC. To conclude, the developed nanoparticles could be internalized by murine microglia cells with an uptake sufficient for MRI. Further investigations are needed to improve cellular labelling in non-phagocytic cells, such as T-cells and stem cells. The use of a PLGA functionalised with a fluorophore could also permit the development of bimodal imaging systems exploiting the modularity of the formulation protocol.

Un ramo fondamentale della medicina rigenerativa si basa sull’utilizzo di cellule in grado di promuovere un effetto terapeutico una volta trapiantate nel corpo del paziente. Queste cellule terapeutiche sono generalmente cellule staminali o pluripotenti o cellule del sistema immunitario. Nonostante gli incredibili risultati ottenuti in fase di sperimentazione preclinica, infatti alcuni tra gli oltre 6000 studi clinici registrati hanno ottenuto l’approvazione dai maggiori organi certificatori internazionali (FDA e EMA), l’applicazione di queste terapie è ancora lontana dal diventare comune ed è limitata dalla mancanza di informazioni riguardanti gli effetti a lungo termine ed ai rischi di tossicità, legati anche alla biodistribuzione di queste cellule in distretti corporei non di loro interesse. Negli anni sono stati studiati sistemi di labeling cellulare per diverse tecniche di imaging. La bioluminescenza (BLI), la fluorescenza (FLI) e l’imaging fotoacustico (PAI) hanno dimostrato di avere una ottima applicabilità in studi preclinici ma, a causa della limitata penetrazione nei tessuti molli, non altrettanto buoni in clinica. La PET e la SPECT, basati sull’utilizzo di radionuclidi, non hanno limiti di penetrazione ma l’impossibilità di ottenere dettagli anatomici, la corta half-life, la bassa risoluzione spaziale e l’esposizione dei pazienti a radiazioni ionizzanti ne hanno limitato lo sviluppo in campo cellulare. La MRI ha dimostrato di essere la più promettente permettendo l’acquisizione contemporanea di dettagli anatomici e funzionali senza limiti di penetrazioni e utilizzando agenti di contrasto non radioattivi. Anche se la sensibilità è limitata. Per il labelling cellulare sono stati ampiamente studiati mezzi di contrasto convenzionali, come ioni di gadolinio chelati e nanoparticelle superparamagnetiche, ma hanno dimostrato seri problemi di tossicità e di non specificità nel rilevamento del segnale. Negli ultimi anni la 19F-MRI ha dimostrato di essere una ottima tecnica complementare da affiancare alla 1H-MRI, grazie ad una sensibilità paragonabile, per il tracking di cellule in vivo grazie all’assenza di fluoro nei tessuti molli, che permette di rilevare in maniera distintiva le cellule marcate. Allo scopo di migliorare la sensibilità in 19F-MRI, molecole ad alto contenuto di fluoro, i.e. perfluorocarburi, sono necessari per raggiungere una concentrazione sufficientemente alta di 19F nelle cellule. Perfluorocarburi come PFPE, PFOB e PFCE sono stati studiati per il labeling cellulare. Recentemente, una molecola superfluorurata chiamata PERFECTA, è stata impiegata con risultati positivi come agente di contrasto in 19F-MRI ed è stata scelta per il presente studio. PERFECTA è facilmente sintetizzabile in elevate quantità, è ben tollerata dalle cellule e la presenza di 36 atomi di fluoro equivalenti permette di osservare un singolo e chiaro segnale in 19F-MRI. Per permettere il labeling cellulare è necessario formulare PERFECTA in emulsioni o NP per poi essere dispersa in una soluzione acquosa e impiegata in ambiente cellulare. Le emulsioni, basate sulla stabilizzazione dei composti fluorurati con polimeri o lipidi, si sono rivelate inizialmente adatte allo sviluppo di sistemi di labeling e, nonostante questi sistemi siano soggetti a fenomeni di instabilità colloidale, sono tuttora molto utilizzati, soprattutto in ricerca preclinica. Recentemente sono stati investigate nanoparticelle di PLGA contenenti un core di PFC e stabilizzati da surfactanti biocompatibili si sono dimostrati interessanti, principalmente grazie alla loro biocompatibilità, biodegradabilità e alla struttura modulare che permette di adattare la formulazione alle richieste specifiche con minime modifiche al protocollo. Per queste ragioni è stato scelto di usare il PLGA come carrier per PERFECTA in questo lavoro di tesi. Per la stabilizzazione delle nanoparticelle di PLGA sono stati proposti un surfactante zwitterionico (Alcol polivinilico, PVA) o uno ionico (colato di sodio, NaC), al fine di indagare gli effetti sull’internalizzazione cellulare di queste nanoparticelle. Quattro differenti formulazioni, PLGA-H-PVA, PLGA-H-NaC, PLGA-PVA e PLGA-NaC, sono state ottenute, usando i due surfactanti menzionati precedentemente e due polimeri di PLGA funzionalizzati diversamente, e caratterizzate da un punto di vista chimico, tramite spettroscopia infrarossa e risonanza magnetica nucleare dell’atomo 19F, ed da un punto di vista di stabilità colloidale con diffusione dinamica della luce (DLS) e analisi del tracciamento di nanoparticelle (NTA) e Zeta-potential. Ottimizzato il protocollo di formulazione per ottenere NP stabili con una elevata efficienza di incapsulamento di PERFECTA, queste sono state usate per marcare cellule murine microgliali (BV-2) per studiare la citocompatibilità e l’efficienza di labeling tramite analisi svolte in 19F-MRI. Un primo protocollo è stato sviluppato e ottimizzato sulla formulazione PLGA-NaC e successivamente adattato alle altre tre formulazioni proposte. L’analisi IR ha confermato la composizione delle NPs e dimostrato l’incapsulamento di PERFECTA all’interno delle nanoparticelle di PLGA senza l’utilizzo di solventi fluorurati. Tramite 19F-NMR si è verificato che PERFECTA non subisca modificazioni chimiche durante la formulazione. L’ottimizzazione del protocollo di sintesi ha la stabilità delle NPs in ambiente acquoso oltre le due settimane e di raggiungere un’efficienza di incapsulazione sufficiente per marcare le cellule con una concentrazione sufficiente tale da avere sensibilità in MRI. Tutte le formulazioni stabilizzate con NaC e con PVA, usate per gli esperimenti di labeling in vitro, hanno un valore di PDI inferiore allo 0.2, e una dimensione approssimativamente di 100 nm e 200 nm, rispettivamente, ulteriormente confermate dalle misure NTA. Le misure di Zeta-potential mostrano una stabilizzazione sterica ad opera della PVA, le cui NPs hanno un valore leggermente negativo di -5 mV, ed un effetto di stabilizzazione elettrostatica per quelle con NaC, risultando in NPs con una carica superficiale di -40 mV. Le analisi in 19F-NMR hanno confermato una concentrazione di atomi di fluoro compresa tra 1.39x1020 e 2.94x1020 19F/ml, corrispondenti ad una efficienza di incapsulazione che varia tra il 22% e il 46%. Con queste formulazioni è stato possibile marcare le cellule con una concentrazione di 1x1014 19F/cellula. In seguito a 4 ore di incubazione, sono stati ottenuti ottimi risultati di vitalità (85% - 98%), confrontabili con quelli ottenuti in condizioni di incubazione normali (93% - 95%). Le stesse cellule sono state fissate e osservate in MRI dimostrando una elevata fagocitosi delle NPs PLGA-H-NaC rispetto alle NPs PLGA-H-PVA, PLGA-PVA e PLGA-NaC. In conclusione, le nanoparticelle sviluppate sono state internalizzate da cellule fagocitarie in quantità sufficienti per la MRI. Ulteriori ricerche e ottimizzazioni sono necessarie al fine di migliorare il labelling cellulare per cellule non-fagocitarie, come i linfociti T e le cellule staminali. Mentre, l’utilizzo di un PLGA funzionalizzato con un fluoroforo permetterebbe di ottenere sistemi bimodali sfruttando la modularità del protocollo di formulazione.