Nanoparticle-based detection of metalloproteinases

Matrix metalloproteinases (MMPs) have attracted considerable attention in recent years because of their involvement in numerous pathological conditions, such as cancer and AIDS. In particular, Matrilysin (MMP-7) is an indicator of salivary gland cancer and is believed to contribute to invasive growth and metastasis of colon carcinoma and numerous other human cancers. The diagnosis techniques available today are not always suitable due to the need of sophisticated, bulky instrumentation and trained personnel. There is thus a great need for easy to use, rapid, specific and sensitive assays that allow detection of MMPs at clinically relevant concentrations for diagnostics. The aim of this project is the production of a simple, cheap and remote kit for fast detection of cancer at its earliest stages and for remote field-testing in resource limited countries. A fluorometric and a colorimetric approach are described in this thesis: both exploiting the catalytic activity that MMPs have on peptide hydrolysis. The colorimetric assay takes advantage of the plasmonic properties of gold nanoparticles. The particles are stabilized with a synthetic polypeptide, hydrolysis of the immobilized peptide by MMP-7 decreases its size and net charge, drastically reducing the colloidal stability of the suspension: the nanoparticles aggregate extensively upon exposure to MMP-7 resulting in a distinct concentration dependent Localized Surface Plasmon Resonance (LSPR) shift, sufficiently large to be detected by naked eye. The fluorometric assay exploits the Förster Resonance Energy Transfer (FRET): a synthetic peptide sequence, labelled with a fluorophore and a quencher is immobilized on particles. Upon MMP-7 exposure, hydrolysis of the peptide cleaves the fluorophore tagged fragment in the solution, distancing it from the quencher and resulting in emission of light by fluorescence that can be detected by naked eye under UV light. This enables a quantitative monitoring of the protease activity. The responses are obtained at clinically relevant concentrations in buffer and show promising activity in clinical sample matrices, thus going towards an application in early diagnosis of the disease.

Le metalloproteasi (MMPs) hanno attratto una considerevole attenzione negli ultimi anni a causa del loro ruolo in numerose patologie, come cancro e AIDS. In particolare, la matrilisina (MMP-7) è un indicatore di tumore alle ghiandole salivari e si ritiene che contribuisca alla crescita invasiva e formazione di metastasi del carcinoma del colon e numerosi altri cancri. Le tecniche di diagnosi disponibili al giorno d’oggi non sono sempre adeguate, data la necessità di macchinari ingombranti, costosi e personale addestrato. Vi è quindi grande richiesta di test rapidi per identificare la MMP-7 a concentrazioni clinicamente rilevanti. Lo scopo di questo progetto è la produzione di un kit semplice ed economico per effettuare diagnosi precoci e per condurre test anche in paesi con risorse limitate. In questa tesi vengono descritte due strategie per l’identificazione delle MMPs, sfruttando la loro attività catalitica sull’idrolisi di peptidi. Il primo approccio sfrutta le proprietà plasmoniche delle nanoparticelle di oro. Le particelle vengono stabilizzate con un polipeptide sintetico, l’idrolisi di questo peptide causato dall’esposizione a MMP-7 riduce la sua dimensione e carica netta, destabilizzando drasticamente la soluzione colloidale e causando l’aggregazione delle nanoparticelle. Le proprietà ottiche delle nanoparticelle cambiano a causa della risonanza plasmonica di superficie, risultando in un cambio di colore della soluzione da rosso a blu visibile ad occhio nudo. Il secondo biosensore è fluorimetrico: sfruttando il trasferimento di energia per risonanza è possibile individuare la proteasi usando un peptide marcato con un fluoroforo e un fluorocromo. L’idrolisi del peptide, immobilizzato su nanoparticelle, causa il rilascio in soluzione del frammento contenente il fluoroforo, risultando in un distanziamento dal fluorocromo e in una emissione di luce per fluorescenza quando illuminato con luce UV. È stato possibile individuare matrilisina a concentrazioni rilevanti clinicamente in soluzioni tampone, mostrando inoltre una sensibilità promettente in campioni di plasma, avvicinandosi quindi all’applicazione del test per la diagnosi precoce di queste patologie.