Characterization of polystyrene nanoparticles and quantitative assessment of their interactions with HeLa cells

Nanoparticles (NPs) are a fundamental nanomedicine tool that have been employed as drug-delivery vehicles, contrast agents and diagnostic tools. Thanks to their size, they are able to interact with cells and intracellular structures at a molecular or nanoscale level. Their effect is strongly dependent on their physico-chemical properties, especially size, shape, charge and surface functionalization. This work focuses on the characterization of commercially available Ps latex NPs and on the assessment of their effect when they interact with a biological system, in particular with HeLa cells. The NPs were either positively charged (aminated) or negatively charged (carboxylated). Both unlabelled NPs and NPs conjugated with a red fluorophore were used. They all had a nominal diameter of 100 nm and spherical shape. The NPs were characterized analysing their fluorescence curve, size and superficial charge. The fluorescence curve of red NPs, obtained measuring the emission curve of eight different NPs concentrations with a microplate reader, showed a good correlation between concentration and emission intensity, with an emission peak at 600 nm. The hydrodynamic diameter, measured with Dynamic Light Scattering (DLS), showed that all NPs were close to 100 nm, with slightly bigger differences for the positively charged ones. The polydispersity index (PDI) indicated good monodispersity for all batches. The Z-potential, measured with Electrophoretic Light Scattering (ELS), showed that negative NPs had a superficial charge between -20 and -25 mV. However, red positive NPs had a charge that was more than double the charge of unlabelled positive NPs (+31.4 and +14.3 mV, respectively). Atomic Force Microscopy (AFM) images also showed NPs sizes close to 100 nm and spherical shapes, with few aggregates. Analysing negative NPs with AFM proved difficult since the support for the analysis also had a negative charge. The NPs effect on biological systems was evaluated on HeLa cells, an immortal tumoral epithelial human cell line, which is one of the most used cell lines in biomedical research. The growth curve of untreated cells was determined and their duplication time was calculated to be 20.42 h. Cells were then treated with NPs concentrations ranging from 2.5 to 25 µg/ml. Initially, only red NPs were used. Cells were observed using a confocal microscope and a SIM. Time lapse procedure was optimized, finding the best seeding concentration (10,000 cells/well using ibidi µ-slide 8-wells plates), the minimum quantity of nuclear dye that guaranteed good visibility while minimizing adverse effects (2 µl/well of hoechst), and solving issues regarding temperature control and the maintenance of sterility within the microscope culture chamber. At early time points, large amounts of positive NPs were either already internalized or surrounding the cells, while there was almost no internalization of negative NPs. Internalization increased for both NPs types after 24h, when the almost totality of NPs was situated close to the nuclei, often grouped close together. Exclusively in the case of positive NPs, an unusually high number of binucleated cells was also observed. SIM observations showed additional information compared to confocal images and they allowed to better discriminate single NPs; using confocal microscopy only, they often appeared as blurred aggregates, while the higher SIM resolution gives a clearer picture of their actual position and showed they did not aggregate as much as it seemed. Projections along the xz and yz planes showed that while NPs tended to surround the nuclei, they did not enter them. Time lapse was also performed on a different line of HeLa cells, which expressed fluorescent Tubulin-eGFP and H2B-mCherry, a cytoskeleton and a histonic protein, to further investigate the presence of binucleated cells. At first, only one binucleated cell was present in the observed field, resulting from the fusion of two initially distinct cells. However, when repeating the experiment, many binucleated cells were observed. They developed as the result of an interrupted cytokinesis processes, where dividing cells had already formed two distinct nuclei and started cytokinesis but did not complete it. It appears that the main mechanism responsible for the formation of binucleated cells is an interference of the red positive NPs with the cell division. In addition to time lapses, cytoskeleton stainings were also performed on fixed regular HeLa cells. H2B-mCherry, in fact, expresses fluorescence that overlaps with the NPs fluorescence, making it difficult to discriminate between NPs and nuclei. Both phalloidin and tubulin stainings were effective and allowed a good visualization of the structures of interest. Tubulin was preferred for its higher versatility in the choice of the fluorophore associated with the secondary antibody. Using SIM and making 3D reconstructions, it is possible to study the colocalization of NPs with other intracellular structures. Quantitative parameters were extracted from fields acquired with the confocal microscope at a 40X magnification. Nine fields were selected for each treatment. Two types of samplings were tested: square, which selected nine adjacent fields in a grid, and random, which selected nine non-adjacent fields within a certain distance from a starting point. The square one was preferred since random sampling fields that did not contain cells were more frequent and there were higher error bars. Images were then analysed using imageJ to quantify the cytoplasm area occupied by NPs and the intensity of internalized NPs at 4, 24 and 72h after incubation. The cytoskeleton staining was used to identify the region of interest and consider exclusively internalized NPs. Both positive and negative NPs were used at concentrations of 2.5, 5 and 25 µg/ml. The area occupied by negative NPs was still close to 0% after 4 and 24h, with slight increases after 72h. The area occupied by positive NPs was higher at all time points and it increased with time, with the exception of the highest concentration which decreased after 72h, possibly due to a toxic effect, since internalization was highest for this condition. Similar results were found regarding internalized NPs fluorescence. To assess the NPs toxicity, MTT and LDH assays were performed using the same NPs concentrations. Positive NPs had a clear time and dose-dependent effect. After 72h, the highest concentration caused a strong mortality and a substantial LDH release, respectively. Results were less pronounced at lower concentrations. Negative NPs had results similar to control, only causing a slight increase in metabolic activity. Flow cytometry was used to quantify NPs uptake and the presence of binucleated cells. After 24h cells that internalized NPs exceeded 95% for both positive and negative NPs, proving a high internalization efficacy. No significant differences were found between samples of fixated and non-fixated cells. Propidium iodide and ToPro-3 were both effective for nuclear staining, but ToPro-3 was selected for its lower overlapping with NPs fluorescence. The intensity of nuclear fluorescence was used to identify the cell cycle phase. After 24h, negative NPs induced no significant differences from control, while positive NPs caused a reduction of cells in G0/G1 and an increase of cells in S or G2 phases. Cells in G2 went from 13% to 31%, indicating an increase of binucleated cells of about 18%. To avoid any interference between NPs and nuclear dye fluorescence, the experiment was repeated using unlabelled Ps latex NPs, but no difference was found between treatments and control. Using a cell counter to compare unlabelled and red NPs toxicity, it was discovered that the unlabelled NPs dose had to be increased fivefold to observe the same toxicity as with red NPs. This difference in the response is likely due to the higher positive Z-potential of red NPs, which is capable of causing damage to the cell membrane and which facilitates the NPs uptake within cells. A greater uptake of equally toxic NPs would in fact lead to a more pronounced toxicity. The manufacturer did not indicate, on the NPs datasheet, the final surface charge at the end of the synthesis. It is clear, however, that even when using NPs of the same material and size, manufactured in the same way, it is not possible to assume a constant Z-potential across different NPs types. It is fundamental to proceed to characterize each new NP type, in order to find out the specific properties of each one.

Le Nanoparticelle (NPs) sono uno strumento fondamentale della nanomedicina e sono state impiegate come carrier per la somministrazione di farmaci, agenti di contrasto e strumenti diagnostici. Grazie alle loro dimensioni sono in grado di interagire con cellule e strutture intracellulari a livello molecolare o nanometrico. Il loro effetto è strettamente correlato alle loro proprietà chimco-fisiche, in particolare dimensione, morfologia, carica e funzionalizzazione superficiale. Questo lavoro si focalizza sulla caratterizzazione di NPs commerciali in polistirene (Ps) latex e sulla valutazione del loro effetto quando interagiscono con sistemi biologici, in particolare con cellule HeLa. Le NPs avevano una carica positiva (amminate) o negativa (carbossilate). Sono state usate sia NPs non marcate sia NPs coniugate con un fluoroforo rosso. Avevano tutte un diametro nominale di 100 nm e forma sferica. Le NPs sono state caratterizzate analizzando la loro curva di fluorescenza, la loro dimensione e la loro carica superficiale. La curva di fluorescenza delle NPs rosse, ottenuta misurando la curva di emissione di otto diverse concentrazioni di NPs con un lettore di micropiastre, mostrava una buona correlazione tra la concentrazione e l’intensità di emissione, con picco di emissione a 600 nm. Il diametro idrodinamico, misurato con dynamic light scattering (DLS), mostra che tutte le NPs erano vicine ai 100 nm, con differenze leggermente più accentuate per quelle cariche positivamente. L’indice di polidispersità (PDI) indica una buona monodispersità per tutti i campioni. Lo Z-potential, misurato con Electrophoretic Light Scattering (ELS), mostra che le NPs negative hanno una carica superficiale compresa tra -20 e -25 mV. Invece le NPs rosse hanno una carica superficiale più che doppia rispetto a quella delle NPs non marcate (+31,4 e +14,3 mV, rispettivamente). Anche le immagini acquisite con microscopia a forza atomica (AFM) mostrano che le NPs hanno dimensioni vicine ai 100 nm e forma sferica, con pochi aggregati. L’analisi delle NPs negative è stata resa difficile dal fatto che anche il supporto per l’analisi aveva carica negativa. L’effetto delle NPs sui sistemi biologici è stato valutato su cellule HeLa, una linea di cellule immortali di tumore epiteliale umano che è tra le linee più usate nella ricerca in campo biomedico. È stata studiata la curva di crescita delle cellule non trattate e il loro tempo di duplicazione è stato calcolato essere di 20,42 ore. Le cellule sono state poi trattate con concentrazioni di NPs tra i 2,5 e i 25 µg/ml. Inizialmente sono state usate solo NPs rosse. Le cellule sono state osservate con microscopio confocale e SIM. La procedura per il time lapse è stata ottimizzata, trovando la concentrazione ottimale di semina (10’000 cellule/pozzetto utilizzando piastre ibidi µ-slide 8-wells), la quantità minima di marcatore nucleare che garantisca una buona visibilità minimizzando gli effetti negativi (2 µl/well of hoechst) e risolvendo problemi connessi al controllo della temperatura e al mantenimento della sterilità all’interno della camera di coltura del microscopio. Nei primi time points, grandi quantità di NPs positive erano già state internalizzate o si trovavano disposte lungo la membrana cellulare, mentre l’internalizzazione di NPs negative era quasi nulla. Dopo 24h l’internalizzazione è aumentata per entrambi i tipi di NPs, con la quasi totalità delle NPs situate vicino ai nuclei, spesso raggruppate tra loro. Solamente per le NPs positive è stato osservato un numero insolitamente alto di cellule binucleate. Le osservazioni al SIM mostrano informazioni aggiuntive rispetto alle immagini al confocale e permettono di discriminare meglio le singole NPs; utilizzando solo il microscopio confocale, apparivano spesso come aggregati sfocati, mentre la più alta risoluzione del SIM fornisce un’immagine più chiara della loro posizione reale e mostra una minore aggregazione rispetto all’impressione iniziale. Le proiezioni lungo i piani xz e yz mostrano che anche se le NPs tendono a circondare i nuclei, non entrano al loro interno. Il time lapse è stato effettuato anche su una diversa linea di cellule HeLa, in grado di esprimere due proteine fluorescenti, una del citoscheletro (Tubulin-eGFP) e una istonica (H2B-mCherry), per investigare ulteriormente la presenza di cellule binucleate. Inizialmente, nel campo osservato era presente un’unica cellula binucleata, che era stata prodotta dalla fusione di due cellule precedentemente distinte. Tuttavia, ripetendo l’esperimento, sono state osservate molte cellule binucleate, che in questo caso si sono formate come conseguenza di un’interruzione della citodieresi. Le cellule in divisione avevano già formato due nuclei distinti e iniziato la citodieresi, ma non l’hanno portata a termine. Il meccanismo maggiormente responsabile per la formazione di cellule binucleate sembra dunque essere un’interferenza causata dalle NPs rosse positive nella divisione cellulare. Oltre ai time lapse, sono stati fatti staining del citoscheletro su cellule HeLa non fluorescenti. La fluorescenza emessa dalla H2B-mCherry, infatti, si sovrappone con quella delle NPs, rendendo difficile la distinzione di NPs e nuclei. Sia lo staining con falloidina sia quello della tubulina sono risultati efficaci e permettono una buona visualizzazione delle strutture d’interesse. La tubulina è stata preferita per la sua maggiore versatilità nella scelta del fluoroforo associato all’anticorpo secondario. Utilizzando il SIM per fare ricostruzioni 3D, è possibile studiare la colocalizzazione delle NPs con altre strutture intracellulari. Dalle immagini al confocale con ingrandimento 40X sono stati estratti parametri quantitativi. Per ogni condizione sono stati selezionati nove campi. Sono stati testati due metodi per la selezione dei campi: campionamento quadrato, in cui venivano selezionati nove campi adiacenti e disposti in una griglia, e campionamento random, in cui venivano selezionati nove campi non adiacenti che si trovavano entro una certa distanza da un punto selezionato. Il campionamento quadrato è risultato preferibile dato che con quello random c’era un maggior numero di campi che non contenevano cellule e le barre d’errore risultavano più elevate. Le immagini sono state analizzate con ImageJ per quantificare l’area occupata dalle NPs e l’intensità di fluorescenza delle NPs dopo un’incubazione di 4, 24 e 72h. Lo staining del citoscheletro è stato utilizzato per identificare una regione d’interesse e considerare solo le NPs internalizzate. Sia le NPs negative sia quelle positive sono state usate a concentrazioni di 2,5, 5 e 25 µg/ml. L’area occupata dalle NPs negative era ancora vicina allo 0% dopo 4 e 24h, con un lieve incremento dopo 72h. L’area occupata dalle NPs positive era più elevata per tutti i time point ed è aumentata nel tempo, con l’eccezione della concentrazione più alta che diminuisce dopo 72 h, forse a causa di una tossicità delle NPs, poiché l’internalizzazione era massima in questa condizione. La fluorescenza delle NPs internalizzate ha dato risultati simili. Per valutare la tossicità delle NPs sono stati eseguiti i saggi MTT e LDH per le precedenti concentrazioni di NPs. Le NPs positive avevano un chiaro effetto tempo e dose-dipendente. Dopo 72h la concentrazione più alta aveva causato un’elevata mortalità e un sostanzioso rilascio di LDH, rispettivamente. I risultati erano meno pronunciati per le concentrazioni più basse. Le NPs negative avevano risultati simili ai controlli, causando solamente un lieve incremento nell’attività metabolica. La citometria a flusso è stata usata per quantificare l’internalizzazione di NPs e la presenza di cellule bionucleate. Dopo 24h le cellule che avevano internalizzato NPs superavano il 95% sia per le NPs negative sia per quelle positive, dimostrando un’elevata efficacia di internalizzazione. Non sono state trovate differenze significative tra i campioni di cellule fissate e non. Sia lo ioduro di propidio sia il ToPro-3 si sono rilevati efficaci per lo staining dei nuclei, ma il ToPro-3 è stato preferito per la minore interferenza con la fluorescenza delle NPs. L’intensità di fluorescenza dei nuclei è stata usata per identificare la fase del ciclo cellulare in cui si trovava ciascuna cellula. Dopo 24h, le NPs negative non avevano indotto differenze significative rispetto al controllo, mentre le NPs positive avevano causato una riduzione delle cellule in fase G0/G1 e un aumento di cellule in fase S o G2. Le cellule in G2 erano passate dal 13% al 31%, implicando un aumento delle cellule binucleate del 18%. Per evitare qualsiasi interferenza tra la fluorescenza delle NPs e quella dello staining dei nuclei, l’esperimento è stato ripetuto utilizzando NPs non marcate, ma non è stata rilevata nessuna differenza tra il controllo e i trattamenti. Utilizzando un contacellule per confrontare la tossicità delle NPs rosse e di quelle non marcate, è stato scoperto che la dose di NPs non marcate doveva essere aumentata di cinque volte per osservare livelli di tossicità pari a quelli delle NPs rosse. Questa differenza è probabilmente dovuta alla maggiore carica positiva delle NPs rosse, che è in grado di causare danni alla membrana cellulare e che favorisce l’uptake delle NPs da parte delle cellule. Un maggiore uptake di NPs con lo stesso livello di tossicità, infatti, causerebbe una tossicità più marcata. Il produttore non aveva indicato, sulla scheda tecnica delle NPs, la carica superficiale al termine del processo di sintesi. Tuttavia, è chiaro che anche utilizzando NPs fatte con lo stesso materiale e dimensioni, prodotte nello stesso modo, non è possibile presumere uno Z-potential costante per i diversi tipi di NPs. È quindi fondamentale caratterizzare ogni nuovo tipo di NPs, in modo tale da determinare le specifiche proprietà di ciascuna.