Microfluidics and biofabrication technologies to study and modulate osteoarthritis-related inflammation in 3D microenvironments

Osteoarthritis (OA) is the most common type of arthritis and affects millions of people worldwide. OA induces the progressive degeneration of the articular cartilage and of the surrounding tissues leading to the loss joint functionality and to a high disability. Nowadays, the current OA therapies are based on symptomatic drugs that do not counteract the disease and, at later disease stages, surgical joint replacement represents the only possible option. Recently, the inflammation of the synovial membrane, called synovitis, has been shown to play a crucial role in the onset and progression of OA pathology, with OA synovial membrane showing a consistent infiltration of macrophages. In this context, the search for new therapies targeting inflammation and focusing on the macrophagic cell component may represent a promising approach for the treatment of this inflammatory disease. In this context, the use of advanced 3D models mimicking the interactions between joint tissues and the complex mechanisms of OA pathology represents a promising tool in view of findings novel OA therapeutic approaches. To this aim, in Chapter 3, we designed and fabricated a microfluidic platform that includes the compartments representing all the main tissues involved in synovitis: the vascularized synovial membrane, the articular cartilage, which is the main target of inflammatory processes, and the synovial fluid that contains pro-inflammatory molecules secreted by tissue-specific cells in the joint. In the design phase, our attention was specifically focused on the dimension of the channel mimicking the synovial venule, which was sized to mimic the shear stress reached in the synovial venule in vivo. The developed microfluidic platform was used in Chapter 4 to recapitulate the mechanism of monocyte extravasation that leads to the abnormal accumulation of macrophages in the synovial membrane. The idea was to reproduce monocyte extravasation in view of targeting this process to develop novel strategies for OA treatment. Synovial fibroblasts and articular chondrocytes were isolated from human OA tissues to model, respectively, the synovial membrane and the articular cartilage. These tissue compartments were separated by a channel for OA synovial fluid injection. The endothelialized channel comprised in the synovial compartment was stimulated by fluid flow and by a pro-inflammatory factor to mimic the in vivo situation. The developed osteoarthritic joint-on-a-chip model was then used to reproduce monocyte extravasation in response to chemoattractant factors. We demonstrated that monocytes specifically extravasated only in the presence of chemokines and that extravasation was enhanced when the endothelium was pre-activated by both fluid flow and inflammatory stimulus. Following the hypothesis that OA synovial fluid contains inflammatory molecules that can promote the recruitment of monocytes, we also provided for the first time a direct evidence that OA synovial fluid induces monocyte extravasation. Besides therapies targeting monocyte extravasation, another approach to regulate inflammation is represented by the modulation of macrophage phenotype once macrophages infiltrate the synovial membrane. Based on environmental stimuli, macrophages can polarize toward an M1 or an M2 phenotype, thus exerting pro-or anti-inflammatory properties, respectively. The idea was to exploit the anti-inflammatory potential of M2 macrophages to modulate inflammation. Besides biochemical factors, also biophysical cues have been shown to play a role in influencing macrophage behavior. Specifically, scaffolds characterised by specific 3D geometric cues have recently emerged as a promising approach to control macrophage phenotype. To this aim, in Chapter 5, we exploited the Melt Electrowriting (MEW) technique to generate Polycaprolactone (PCL) scaffolds with different 3D architectures to study their influence on macrophage response in terms of cell morphology, surface marker expression and secretion of pro- and anti-inflammatory proteins. Different architectures based on different pore geometries were generated: square, triangle and rhombus. Macrophages showed a different morphology when in contact with different scaffold architectures in correspondence of angles: macrophages formed “bridges” in the square and triangle scaffolds, while in the rhombus this did not occur. On the contrary, rhombus enhanced the elongation of cells along fibers. Among all architectures, the rhombus was the only one that enhanced the secretion of all the analyzed anti-inflammatory proteins (IL1RA, IL10, IL13, CCL22, CCL24), with a significant difference for IL10 compared to PCL films. To summarize, in the present PhD thesis, we presented two different approaches that can be pursued for the development of novel therapies counteracting OA-related inflammation. In one case, therapies aiming at blocking monocyte recruitment to the synovial membrane can be developed to prevent the negative consequences caused by the abnormal infiltration of monocytes. In the other case, therapies aiming at exploiting the anti-inflammatory properties of macrophages can be developed to promote a tissue healing-friendly environment.

L'osteoartrosi è la più comune forma di artrosi che colpisce milioni di persone in tutto il mondo. L'osteoartrosi provoca la degenerazione progressiva della cartilagine articolare e dei tessuti circostanti portando alla perdita della funzionalità articolare e ad un'elevata disabilità. Al giorno d'oggi, le terapie per il trattamento dell’osteoartrosi si basano su farmaci che alleviano i sintomi e che quindi non contrastano la malattia e, nei casi più gravi, la chirurgia protesica rappresenta l'unica opzione possibile. Recenti studi hanno dimostrato che l'infiammazione della membrana sinoviale, definita sinovite, svolge un ruolo cruciale nell'insorgenza e nella progressione dell’osteoartrosi, e che la membrana sinoviale osteoartrosica è caratterizzata da una costante infiltrazione di macrofagi. In questo contesto, la ricerca di nuove terapie mirate all'infiammazione e alla componente cellulare macrofagica può rappresentare un approccio promettente per il trattamento di questa malattia infiammatoria. In questo contesto, l'utilizzo di modelli 3D avanzati che riproducono le interazioni tra i tessuti articolari e i complessi meccanismi dell’osteoartrosi rappresenta uno strumento promettente per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici per la cura dell’osteoartrosi. A questo proposito, nel capitolo 3, abbiamo progettato e fabbricato una piattaforma microfluidica che comprende diversi compartimenti che rappresentano i principali tessuti coinvolti nella sinovite: la membrana sinoviale vascolarizzata, la cartilagine articolare, che è il principale bersaglio dei processi infiammatori e il liquido sinoviale che contiene molecole pro-infiammatorie secrete da cellule tessuto specifiche dell'articolazione. In fase di progettazione, la nostra attenzione si è focalizzata sulla dimensione del canale microfluidico che rappresenta la venula sinoviale per riprodurre lo sforzo di taglio raggiunto nella venula sinoviale in vivo. La piattaforma microfluidica che è stata sviluppata è stata utilizzata nel capitolo 4 per riprodurre il meccanismo di extravasazione dei monociti che porta all'anomalo accumulo di macrofagi nella membrana sinoviale. L'idea era di riprodurre l’extravasazione dei monociti per identificare nuove strategie per il trattamento dell'osteoartrosi che avessero come target questo processo biologico. I fibroblasti sinoviali e i condrociti articolari sono stati isolati dai tessuti umani osteoartrosici per riprodurre, rispettivamente, la membrana sinoviale e la cartilagine articolare. Questi compartimenti sono stati separati da un canale dedicato all'iniezione di liquido sinoviale di pazienti affetti da osteoartrosi. Il canale endotelializzato compreso nel compartimento sinoviale è stato stimolato dal flusso e da un fattore pro-infiammatorio per riprodurre la situazione in vivo. Il modello microfluidico che riproduce l’unità articolare è stato quindi utilizzato per riprodurre l’extravasazione di monociti in risposta a fattori chemoattraenti. Abbiamo dimostrato che i monociti hanno extravasato solo in presenza di chemochine e che l’extravasazione dei monociti è aumentata quando l’endotelio è stato precondizionato dal flusso e dallo stimolo infiammatorio. Inoltre abbiamo dimostrato per la prima volta che il liquido sinoviale osteoartrosico induce l’extravasazione dei monociti confermando l'ipotesi che il liquido sinoviale di pazienti affetti da osteoartrosi contiene molecole infiammatorie che possono favorire il reclutamento di monociti. Oltre alle terapie mirate a contrastare l’extravasazione dei monociti, un altro approccio per regolare l'infiammazione nell’osteoartrosi è la modulazione del fenotipo dei macrofagi che si infiltrano nella membrana sinoviale. In base agli stimoli ambientali, i macrofagi possono polarizzare verso un fenotipo M1 o M2, esercitando rispettivamente proprietà pro-o anti-infiammatorie. L'idea era di sfruttare il potenziale antinfiammatorio dei macrofagi M2 per modulare l'infiammazione. Oltre ai fattori biochimici, è stato dimostrato che anche i fattori biofisici svolgono un ruolo nel modificare il comportamento dei macrofagi. In particolare, gli scaffold caratterizzati da specifiche caratteristiche geometriche sono stati recentemente studiati per la loro capacità nel modulare il fenotipo dei macrofagi. A questo scopo, nel capitolo 5, abbiamo sfruttato la tecnica di Melt Electrowriting (MEW) per produrre scaffold di policaprolattone (PCL) caratterizzati da diverse conformazioni geometriche per studiare il loro effetto sui macrofagi in termini di morfologia cellulare, espressione di marker superficiali e secrezione di proteine pro- e anti-infiammatorie. Sono state sviluppate diverse configurazioni geometriche con pori di diversa geometria: quadrato, triangolo e rombo. I macrofagi hanno assunto una morfologia diversa in corrispondenza degli angoli in base alle diverse configurazioni geometriche con le quali sono entrati in contatto: i macrofagi hanno formato "ponti" nelle geometrie quadrate e triangolari, mentre in quelle romboidali ciò non si è verificato. Al contrario, le geometrie romboidali hanno provocato l'allungamento delle cellule lungo le fibre. Il rombo è stata l’unica geometria che ha aumentato la secrezione di tutte le proteine anti-infiammatorie analizzate (IL1RA, IL10, IL13, CCL22, CCL24), con una differenza significativa per IL10 rispetto al gruppo di controllo rappresentato da film 2D di PCL. Concludendo, nella presente tesi di dottorato, abbiamo presentato due diversi approcci che possono essere perseguiti per lo sviluppo di nuove terapie che contrastano l'infiammazione nell'osteoartrosi. In un caso, possono essere sviluppate terapie volte a bloccare il reclutamento dei monociti nella membrana sinoviale per prevenire le conseguenze negative causate dall'anormale infiltrazione dei monociti. Nell'altro caso, possono essere sviluppate terapie volte a sfruttare le proprietà antinfiammatorie dei macrofagi per promuovere un ambiente favorevole alla guarigione dei tessuti.