Design and development of a combined Raman and laser-induced fluorescence optical microscope

The aim of this thesis work is to present the designing, development and characterization of a novel optical hybrid setup which combines fluorescence and Raman spectroscopy techniques. The main strength in combining these two techniques comes from the fact that they are both optical, non-invasive and non-destructive techniques. Each of them has both advantages and drawbacks that we will deeply analyse in Chapter 1, however combining them in a single setup means take advantage of their complementarity in order to perform a more detailed and deeper investigation on the sample than using a single technique. This aspect will be further analysed in Chapter 5 where we will show the results of a measurement performed by the setup, highlighting the importance of having both techniques in order to provide a complete framework of the sample identifying all the materials that are present. The system has been designed to work with samples belonging to the material science field, and it allows to perform a mapping of the sample by exploiting a raster-scanning approach. In Chapter 1 the theoretical physics concepts at the basis of the thesis work are presented. In the first part we recall the phenomenon of fluorescence emission describing its representation through Jablonski diagram and discussing its characteristics and its main parameters. In the second part we introduce the Raman scattering theory by a classical treatment approach, and we discuss the main characteristics. An entire section is dedicated to a critical analysis of having a hybrid setup and the advantages that it allows to explore, finally a brief mention on the fluorescence and Raman spectroscopic techniques is presented for sake of completeness. Chapter 2 is a further introductive chapter which deals with the principles of spectroscopy and microscopy. The setup is an optical microscope, and the signal collected by the sample is sent into two spectrometers, one for fluorescence and one for Raman, in order to analyse its spectrum. Specifically, the setup allows to perform a mapping of the sample by exploiting a raster-scanning approach, therefore the collected dataset is a three dimensional data-cube which contains information about the intensity of the collected radiation for each wavelength and position over the scanned area (x,y,λ). In order to retrieve the spectrum of the signal coming from the sample, a dispersive spectrometer in Czerny-Turner configuration is used, both in case of fluorescence and Raman analysis; therefore in this chapter the dispersive spectrometer and its main figure of merits are discussed in-depth. Finally, there is an introduction to optical microscopy, with a focus on 4f optical systems, since it is the configuration that we used in all the paths of the setup. The system has been analysed by a Fourier optics approach in order to retrieve the expressions of the optical functions of such a system and the expressions of the lateral and axial resolution. After the first two theoretical and introductive chapters, the setup is finally presented in Chapter 3, where there is a description of all the optical paths and a first theoretical estimate of the excitation spot size. The main requirements for the choices of the optical elements during the designing phase were to have a spot size on the sample that allowed to analyse mainly solid-state samples but also some biological ones, and to collect the maximum signal at the detectors. This chapter goes in-depth critically motivating the designing choices that have been made considering the possible trade-offs. After the designing phase, the behaviour of the setup has been simulated in detail, especially regarding the dimension of the excitation spots on the sample and the spectral resolution achievable. A particular mention must be done for the Raman excitation path because of the use of a single mode fiber, therefore the simulation has been done considering the gaussian beam laws, which are recalled in Appendix A. With regarding to spectral resolution we explored both the non-diffractive and the diffractive regime, analysing the behaviour of the system as a function of the dimension of the entrance fiber of the spectrometer, which is the main critical parameter to take into account. After the description and the theoretical estimation of its main parameters, the setup has been characterized to evaluate how much its performance was different from ideality. Chapter 4 presents the setup characterization regarding the alignment of the UV and IR spots, the Field of View of the camera, the excitation spot size and power on the sample, the dimension of the detected area both for fluorescence and Raman path, and the readout and dark noise of the detectors. Moreover, some spectra of well-known materials have been acquired in order to verify the goodness of the measurements from a quantitative point of view. The chapter shows that the results are quite satisfying and the actual behaviour of the setup is very close to the one simulated in Chapter 3, especially regarding the dimensions of the excitation spots and the FoV of the camera, bearing in mind the nonidealities introduced by the optical elements. Finally, the setup has been used to perform a real measurement (Chapter 5) by using a raster-scanning approach on a stratigraphy sample, coming from a Larionov painting. In conservation science, the identification of painting materials is fundamental for the study of artists’ palettes, for dating and for understanding on-going degradation phenomena. Optical spectroscopy techniques are retained as standard non-destructive techniques for this kind of investigation, specifically fluorescence spectroscopy, allows to simply evaluate the distribution of heterogeneities on surfaces or on micro-samples, while Raman spectra are successfully used as a fingerprint for the identification of the pigments. The Chapter presents the protocol followed to perform both the measurement and the analysis of the dataset, clearly identifying the parameters set for all the instrumentation. Results are presented and further discussed comparing them with the literature, highlighting how they confirm the strengths of the setup.

Lo scopo di questa tesi è presentare la progettazione, lo sviluppo e la caratterizzazione di un innovativo microscopio ottico che combina spettroscopia Raman e di fluorescenza laser-indotte. Il punto di forza principale della combinazione di queste due tecniche risiede nel fatto che sono entrambe tecniche ottiche non invasive e non distruttive. Ciascuna di esse ha vantaggi e svantaggi che saranno analizzati approfonditamente nel Capitolo 1, tuttavia la combinazione di esse in un singolo setup permette di sfruttare la loro complementarità per eseguire sul campione un’analisi più dettagliata rispetto a quella che si avrebbe se utilizzassimo una sola di queste due tecniche. Questo aspetto sarà ulteriormente messo in evidenza nel Capitolo 5 dove saranno mostrati i risultati di una misura eseguita dal setup su una stratigrafia pittorica, sottolineando il contributo di entrambe le tecniche di spettroscopia per fornire un quadro generale completo del campione e dei materiali contenuti al suo interno. Il sistema è stato progettato per esaminare campioni nell’ambito del material science, ed esso permette di eseguire una mappatura del campione con un modello di acquisizione degli spettri di tipo raster-scan. Il Capitolo 1 presenta i concetti fisici teorici alla base del lavoro di tesi. La prima parte richiama il fenomeno della fluorescenza descrivendone le caratteristiche e i parametri fondamentali e ricorrendo all’uso del diagramma di Jablonski. Nella seconda parte viene trattata la teoria alla base della diffusione Raman utilizzando un approccio classico. Vi è poi un’intera sezione dedicata alla discussione critica sui vantaggi che un sistema ibrido come il nostro permette di esplorare, infine, per completezza della trattazione, viene fatto un breve cenno alle altre tecniche di spettroscopia Raman e di fluorescenza presenti in letteratura. Il Capitolo 2 è ancora un capitolo introduttivo che affronta i principi della spettroscopia e della microscopia. Questo perché il setup analizzato in questa tesi è un microscopio ottico in cui il segnale raccolto dal campione viene inviato e successivamente analizzato da due spettrometri, uno per la fluorescenza e uno per il Raman. In particolare, il setup permette di eseguire una mappatura del campione sfruttando il modello di acquisizione raster-scan, per questo i dati raccolti hanno la struttura di un cubo tridimensionale che contiene informazioni riguardo l’intensità della radiazione rivelata per ogni lunghezza d’onda e coordinata spaziale sul campione (x,y,λ). Per ottenere lo spettro del segnale rivelato, viene usato uno spettrometro dispersivo in configurazione Czerny-Turner sia nel caso del segnale di fluorescenza che in quello Raman; pertanto, questo capitolo tratta nel dettaglio la fisica e l’ingegneria di uno spettrometro dispersivo evidenziandone i principali parametri di design. Infine, vi è una introduzione alla microscopia ottica, con una attenzione particolare ai sistemi 4f, dal momento che tale configurazione è alla base dei cammini ottici del nostro setup. Il sistema è stato analizzato attraverso le leggi dell’ottica di Fourier al fine di ricavare le espressioni della risposta all’impulso e della funzione di trasferimento, e delle risoluzioni laterale e assiale. Dopo i primi due capitoli introduttivi riguardo i fondamenti di fisica e di ingegneria del setup, quest’ultimo è presentato nel Capitolo 3, dove vi è una descrizione di tutti i cammini ottici presenti e una prima stima sulla dimensione degli spot di eccitazione sul campione. Le condizioni principali per la scelta degli elementi ottici da utilizzare nel setup erano soprattutto due: avere una dimensione degli spot sul campione tale da permettere lo studio di campioni di ambito material science, e qualcuno in campo biologico; raccogliere il segnale massimo ai rivelatori. Questo capitolo motiva in maniera approfondita le scelte di progettazione che sono state fatte considerando i possibili trade-off. Dopo una prima fase di progettazione, il comportamento del setup è stato simulato nel dettaglio, specialmente per quanto riguarda i valori di dimensione degli spot di eccitazione sul campione e di risoluzione spettrale. Una nota di rilievo è per il cammino per l’eccitazione della diffusione Raman. Viene infatti utilizzata una fibra monomodale, pertanto la simulazione del comportamento della luce è stata fatta utilizzando le leggi del fascio gaussiano, la cui teoria è richiamata in Appendice A. Per quanto riguarda invece la risoluzione spettrale, è stato analizzato il comportamento del sistema sia in regime non diffrattivo che in quello diffrattivo, a seconda del variare della dimensione della fibra di ingresso dello spettrometro. Dopo la descrizione del setup e la stima teorica dei suoi parametri, il setup è stato caratterizzato per stimare quanto le sue reali performance si discostassero da quelle teoriche. Il Capitolo 4 presenta la caratterizzazione del setup relativamente all’allineamento degli spot UV e IR, al campo visivo della camera, alla dimensione degli spot e alla relativa potenza sul campione. Sono stati stimati inoltre la dimensione dell’area del campione da cui i detector rivelano il segnale e il rumore di fondo dei detector stessi. Oltre a ciò, spettri di materiali conosciuti sono stati acquisiti per verificare la bontà delle misure da un punto di vista quantitativo. Il capitolo mostra che i risultati ottenuti sono soddisfacenti e che il comportamento del sistema è simile a quello simulato nel Capitolo 3, in particolar modo riguardo alla dimensione degli spot di eccitazione e del campo visivo della camera, tenendo comunque a mente le non idealità presenti negli elementi ottici. Infine, il setup è stato usato per eseguire una mappatura (Capitolo 5) di una stratigrafia pittorica di un’opera dell’artista Larionov. Nel settore dei beni culturali, l’identificazione dei materiali pittorici è fondamentale nello studio delle tavolozze degli artisti, per la datazione e per la comprensione dei fenomeni di degradazione in corso. Le tecniche di spettroscopia ottica hanno un ruolo da protagonista in questo senso, in particolare la spettroscopia di fluorescenza permette di verificare con semplicità la presenza di eterogeneità sulle superfici o su micro-campioni, mentre gli spettri Raman sono usati come impronte digitali per l’identificazione dei pigmenti. Il capitolo presenta i protocolli seguiti per la misura e l’analisi dei dati, mettendo in rilievo i parametri impostati nella strumentazione. I risultati sono successivamente discussi e messi in relazione a quanto riportato in letteratura, evidenziando come essi confermino i punti di forza del setup.