Design and realisation of a 3D highly perfusable scaffold through indirect extrusion bioprinting

Regenerative Medicine stands for medical therapies aimed to restore or to establish physiological functions by replacing, restoring and regenerating damaged or diseased cells, tissues or organs. The main components in this field are: cells, scaffolds and stimuli, which are used to recreate the patient’s tissue in vitro; when all these components are combined the strategy is usually referred as “Tissue Engineering”. The principal limitation in this type of application is the lack of an efficient vascularisation, which manages the transport of oxygen, nutrients and catabolites removal; this condition is particularly necessary for thick engineered tissues, which otherwise may incur in the death of the cells present in the tissue core. Several strategies and applications, aimed to overcome the lack of vascularisation, are present in the literature and some of the most relevant ones are analysed and reported in this thesis work. The analyses related to the 3D bioprinting technique, and to its relative applications, result more detailed due to the relevance for this reported work. In particular, the vascularised construct recently realised by Ouyang et al., which consist in a 3D cubic lattice obtained through sacrificial hydrogel removal, is the one which mostly inspired the geometry and the printing procedure of the reported 3D perfusable scaffold. The aim of this thesis project is to find an accurate and reproducible printing protocol to obtain vascularised constructs through Indirect Extrusion Bioprinting, which has been applied to obtain a scaffold with the 3D designed network. The reported protocol is based on the print of a synthetic sacrificial hydrogel, in particular Pluronic®, to accurately obtain the desired network and to support the entire structure during the printing process; the three dimensional network is the result of crossing channels of adjacent layers without vertical printed structures. Initially the effective extrusion of the Pluronic® and the relative obtained structures have been studied, to find the optimal printing parameters and the possible unexpected limitations. Once optimised the printing process, the following step has been focused on the removal of the Pluronic® from a bulk structure, in this case a synthesised Alginate-Gelatine hydrogel. The hydrogel extruded to realise the matrix of the vascularised scaffold is a 50/50 blend of Alginate-Gelatine; the composition of this hydrogel derives from the studies of such material in parallel thesis works, even if in this application the amount of Gelatine results slightly lower to facilitate the extrusion through the employed needle. The design of the vascularised scaffold has been obtained considering the dimensions of the printed filaments, of both employed hydrogels; the resulting vascular network, as shown in the figure 1, is a lattice formed by crossing cylinders with a diameter of 500 µm. This thesis is aimed to make another step towards the resolution of the major limitation in the Tissue Engineering field, for this reason results necessary study the fluid dynamic behaviour of the network to evaluate the compatibility of the perfused structure with cellular survival. For this reason, analytical calculations have been carried out to find the maximum appliable flow rate, without inducing a cellular detachment caused by a too high wall shear stress value (1 Pa). Computational analyses, performed through the software Ansys Fluent, have followed to have a prevision of wall shear stress distribution in the structure. Furthermore, a bioreactor (Figure 2) able to support the printing and perfusion process have been designed and realised. The bioreactor is composed of PLA parts, fabricated through 3D FDM printing, and a silicone part obtained casting a ABS 3D printed mold. In conclusion the sacrificial and matrix components have been printed on the bottom of the bioreactor, as represented in figure 3; once completed the printing process the matrix has been chemically and thermally crosslinked. The sacrificial structure has been then removed, leaving behind a vascularised scaffold, thus the scaffold has been perfused with water, coloured with methylene blue, to display the vascular formation. The obtained bioreactor design and the bioprinting procedure resulted so compatible with 3D vascularised scaffold fabrication. This work can be considered a good starting point for further studies regarding Indirect Extrusion Bioprinting, in facts it shows a procedure, employed to realise an accurate perfusable structure, enhancing physical stability during the printing process.

La Medicina Rigenerativa si occupa delle terapie mediche mirate a ripristinare o stabilire le funzioni fisiologiche di cellule, tessuti o organi danneggiati. Le componenti principali di questo campo sono: cellule, scaffold e stimuli, i quali vengono utilizzati per ricreare il tessuto del paziente in vitro; quando tutte queste componenti vengono combinate la strategia viene denominata “Ingegneria dei Tessuti”. In questo tipo di applicazione il limite principale risiede nella mancanza di un’efficiente vascolarizzazione, la quale provveda al trasporto di ossigeno, nutrienti e rimozione dei cataboliti; questa condizione risulta particolarmente necessaria per tessuti ingegnerizzati dal considerevole spessore, nei quali le cellule presenti nella parte interna potrebbero morire. Allo stato dell’arte sono presenti diverse strategie e applicazioni, con il fine di superare il problema della mancanza di vascolarizzazione; alcune tra le più rilevanti sono riportate e analizzate in questo lavoro di tesi. Le analisi inerenti alla tecnica di Biostampa 3D e alle sue applicazioni risultano descritte in maniera più dettagliata, vista la maggior rilevanza per il lavoro presentato. In particolar modo il costrutto vascolarizzato ottenuto da Ouyang et al., ovvero un reticolo cubico tridimensionale ottenuto tramite la rimozione di un idrogelo sacrificale, è stato preso come ispirazione principale per la geometria e la procedura di stampa dello scaffold 3D realizzato. L’obiettivo di questo progetto di tesi è la ricerca di un protocollo di stampa accurato e riproducibile per l’ottenimento di costrutti vascolarizzati, attraverso la tecnica di Biostampa ad Estrusione Indiretta, la quale è stata applicata per la realizzazione dello scaffold con integrata la rete vascolare 3D progettata. Il protocollo presentato è basato sulla stampa di un idrogelo sintetico sacrificale, nel caso in esame il Pluronic®, per ottenere in maniera accurata la rete desiderata e per garantire un supporto meccanico all’intera struttura durante il processo di stampa; la rete tridimensionale è stata generata dall’intersezione di canali appartenenti a strati adiacenti, senza l’ausilio di stampe di strutture verticali. Inizialmente sono state studiate l’effettiva estrusione del Pluronic® e le relative strutture ottenute, al fine di ottimizzare i parametri di stampa e ritrovare possibili limitazioni. Successivamente, una volta ottimizzato il processo di stampa, il lavoro di studio è stato incentrato sul processo di rimozione del Pluronic® dalla struttura circostante, ossia un idrogelo sintetizzato di Alginato e Gelatina. L’idrogelo estruso per realizzare la matrice dello scaffold, consiste in una miscela 50/50 di Alginato e Gelatina; la composizione di tale idrogelo origina da studi di tesi paralleli svolti su questo materiale, sebbene nella presente applicazione il quantitativo di gelatina risulta leggermente inferiore, al fine di facilitare il processo di estrusione attraverso l’ago adottato. Il design dello scaffold vascolarizzato è stato ottenuto valutando le dimensioni dei filamenti estrusi, di entrambi gli idrogeli; la struttura vascolare risultante, mostrata in figura 5, è un reticolo formato da cilindri di diametro pari a 500 µm. Questa tesi è mirata a realizzare un passo verso la risoluzione del limite principale dell’Ingegneria dei Tessuti, perciò risulta fondamentale lo studio del comportamento fluido dinamico della rete al fine di valutare la compatibilità della struttura perfusa con la sopravvivenza cellulare. Per questo motivo sono stati effettuati calcoli analitici al fine di trovare il massimo valore del flusso applicabile, senza incorrere in un distacco cellulare causato da un valore di sforzo di taglio troppo elevato (1 Pa). In seguito sono state svolte delle analisi computazionali, tramite software Ansys Fluent, al fine di avere una previsione sulla distribuzione dello sforzo di taglio nella struttura. Inoltre, è stato progettato e realizzato un bioreattore (Figura 6) in grado di svolgere un ruolo di supporto durante i processi di stampa e perfusione. Il bioreattore è composto da parti in PLA, ottenute tramite una stampante 3D, e una parte in silicone, la quale è stata ottenuta come negativo di uno stampo in ABS, anch’esso ottenuto tramite stampa 3D. Infine le componenti sacrificale e matriciale sono state stampate sulla base del bioreattore, come riportato in figura 7; una volta completato il processo di stampa la matrice è stata cross-linkata chimicamente e termicamente. La struttura sacrificale è stata poi rimossa, ottenendo così uno scaffold vascolarizzato, il quale è stato successivamente perfuso con acqua (colorata con blu di metilene), al fine di mostrare l’avvenuta formazione dei canali. Il design del bioreattore e il processo di biostampa risultano quindi compatibili con la realizzazione di scaffold tridimensionali vascolarizzati. Questo lavoro può essere considerato un ottimo punto di partenza per ulteriori studi inerenti alla Biostampa a Estrusione Indiretta, infatti illustra una procedura, utilizzata per la realizzazione accurata di strutture perfondibili, incrementando la stabilità fisica durante tutto il processo di stampa.