Light sheet fluorescence microscopy on chip : automatic cell detection and image post-processing

Light Sheet Fluorescent Microscopy (LSFM) is a powerful tool to study biological samples with dimensions ranging from microns up to several millimetres. Fluorescent specimens are optically sectioned by a light sheet and the re-emitted light is collected by an objective placed orthogonally to the excited plane. Moving the sample across the light sheet, it is possible to illuminate slice by slice the entire sample. The light signal is acquired by a camera sensor to produce images for each illuminated plane, allowing a 3D reconstruction of the specimen. LSFM can be performed on optofluidic chips, low-cost and portable devices containing a microfluidic network in which small biological samples can flow. High-throughput measurements can be achieved thanks to a continuous delivery of sample provided by an external fluidic system. The setup used in this thesis work performs this kind of measurements for the study of cellular population heterogeneity. A cylindrical microlens fabricated inside an optofluidic chip generates a light sheet which cover a microchannel section in which the sample flows. Thanks to a pumping fluidic system, the cells continuously cross the light sheet and the light emitted from the excited slices is acquired by a camera. My thesis work mainly devoted to automizing the sample scanning procedure. In particular, I upgraded the setup control software implementing an algorithm which recognizes the presence of cells inside a frame and automatically saves the correspondent regions of interest (ROI) inside a file with corresponding metadata. Together with the already performed automatic cell delivery, the setup can autonomously operate, without the user intervention. Moreover, the necessary storage space is highly reduced saving only ROIs instead of full frame images. Recognized cells are also graphically identified in the acquired images displayed on a PC screen in real time, highlighting the cell contours and the rectangle delimiting the saved ROIs. I performed several measurement sessions to both test the new software and acquire data. The saved image stacks usually need to be processed in order to extract from them the correct information. Indeed, as in all the optical techniques, images are affected by blurring caused by the optics of the apparatus. Moreover, in this specific case, in which the sample is dissolved in a liquid, the Brownian motion and other microfluidic phenomena can change the cell position inside the microchannel. To solve these problems, two Python codes have been written for this thesis work: the first to perform the images deconvolution using the Richardson-Lucy method and the other to perform a registration algorithm.

La tecnica di Light Sheet Fluorescent Microscopy (LSFM) è un potente strumento per lo studio di campioni biologici aventi dimensioni che vanno dai micron fino a diversi millimetri. Un foglietto di luce seziona otticamente il campione fluorescente e la luce riemessa viene collezionata da un obiettivo di detezione posto con l’asse ortogonale al piano illuminato. L’intero campione viene illuminato sezione per sezione, muovendolo attraverso il foglio di luce. Il segnale luminoso riemesso viene acquisito da una camera che produce un’immagine per ogni piano illuminato, permettendo una ricostruzione 3D del campione. È possibile implementare la LSFM su chip optofluidici, ovvero dispositivi dalle ridotte dimensioni e con bassi costi di produzione che contengono una rete di microcanali nei quali il campione biologico può fluire. L’analisi di un numero elevato di campioni in una singola sessione di misura è resa possibile da un sistema fluidico che continua a far fluire il campione all’interno del chip. Il setup utilizzato per questo lavoro di tesi sfrutta proprio questa LSFM su chip per effettuare uno studio sulla eterogeneità di popolazioni cellulari. Una microlente fabbricata all’interno del chip optofluidico genera un foglietto di luce all’interno del microcanale nel quale scorrono le cellule. Esse attraversano il foglietto di luce spinte da un sistema di pompaggio esterno e la luce riemessa dal piano eccitato viene acquisita da una telecamera. Il mio lavoro di tesi ha riguardato principalmente l’automatizzazione della procedura di scansione del campione. In particolare, ho implementato nel software di controllo del setup un algoritmo per il riconoscimento automatico di cellule all’interno di un frame e il conseguente salvataggio delle corrispondenti regioni di interesse (ROIs) in un file, assieme ai relativi metadati. Questo, insieme al continuo rifornimento di campione, rende il sistema autonomo, senza necessità di interventi da parte dell’utente. Inoltre, lo spazio di memoria necessario per il salvataggio dei dati acquisti è stato notevolmente ridotto in quanto solo le regioni d’interesse contenenti cellule vengono salvate, al posto delle immagini full frame. Le cellule riconosciute vengono identificate anche graficamente sulle immagini mostrate a schermo in tempo reale, sottolineandone i contorni e il rettangolo che delimita la corrispondente ROI. Ho effettuato diverse sessioni di misura con il duplice scopo di testare il nuovo software e acquisire dati. Generalmente, le immagini salvate devono essere opportunamente processate per permettere la corretta estrazione di informazioni. Infatti, fenomeni di sfuocatura come quelli introdotti dall’ottica dello strumento, sono tipicamente presenti nelle immagini acquisite con tecniche di microscopia ottica. Inoltre, nel caso specifico in questione nel quale il campione è dissolto in un liquido, fenomeni dovuti al moto Browniano e ad altri fattori fluidici possono modificare la posizione della cellula all’interno del microcanale. Per risolvere questi problemi, due codici Python sono stati scritti per questo lavoro di tesi: il primo per la deconvoluzione di immagini usando il metodo Richardson-Lucy e il secondo per svolgere un algoritmo di registrazione di immagini.