Development of a microfluidic sample preparation system for bacteria magnetic labelling and capture in clinical samples

Hospital infections represent one of the novel health care challenges of the new century and rapid, economic and efficient technique for their detection are essential for rapid isolation of the patient and limited diffusion. Magnetic cytometry represents an emerging platform for bacteria detection, but complexity of the sample matrix and necessity of bacteria cell labelling require a preparative step. In the frame of a LoC (Lab on Chip) device PoC-oriented (Point of Care), such sample pre-treatment must be integrated in the cytometer and thus realized as a microfluidic component. Needed steps are bacteria labelling with magnetic particles and their concentration in a smaller volume, while unwanted components of the original sample, as other bacteria or residues, are discarded; labelling requires that recognition elements (here antibodies) specific for the target bacteria are immobilized on magnetic particles. As concerning the following study, a manually operated assay for antibodies immobilization and bacteria capture and concentration has been optimized. A PDMS based microfluidic device, in two variants, have been produced and the parameters from the previous optimized protocol, such as ratios between antibodies, particles and bacteria have been applied to automatize sample pre-treatment through a new assay based on the device. Devices ability on bacteria labelling and concentration have been evaluated and compared with results from manual assay, verifying if the former could be a substitute for the latter. Microfluidic devices have been tested with spiked samples at different concentrations, as controlled solution of target bacteria in buffer, and with hospital samples, representing all the complexity of the real matrix. Efficiency in processing spiked sample is quantified and a mean capture efficiency of 86% ± 9% is obtained at a concentration of 2*10^5 CFU/ml, while the lowest concentration capture with reasonable difference between positive and negative control is 2*10^3CFU/ml. Processing of hospital sample offered limited results due to high variability in sample concentration and limited tests, even though capture is observed and qualitative results are promising. The experimental work present in this thesis have been accomplished at Instituto de Engenharia de Sistemas e Computadores – Microsistemas e Nanotecnologias INESC-MN laboratories, in collaboration with Instituto Superior Técnico (IST), in Lisbon, Portugal.

Le infezioni ospedaliere rappresentano una delle nuove sfide di questo secolo e rapide, economiche e efficienti tecniche per la loro rilevazione sono essenziali al rapido isolamento del paziente e per una limitata diffusione. La citometria magnetica rappresenta una piattaforma emergente nella rilevazione batterica, ma la complessità della matrice e la necessità del marcamento (labelling) della cellula batterica richiedono una fase preparatoria. Nella visione di un dispositivo LoC (Lab on Chip) orientato al Point of Care (PoC) , tale pre-processamento del campione necessita di essere integrato nel citometro e realizzato anch’esso come componente microfluidico. Le fasi necessarie sono il marcamento (labelling) e il concentramento in un volume minore, mentre componenti di rifiuto come altri batteri o residui vengono scartati; il marcamento richiede che gli elementi di riconoscimento (qui anticorpi) specifici per il batterio bersaglio vengano immobilizzati su particelle magnetiche. Per ciò che concerne il seguente studio, è stato ottimizzato un protocollo manuale per l’immobilizzazione delle immunoglobuline e la cattura e concentrazione dei batteri. Inoltre, un dispositivo microfluidico in PDMS, in due varianti, è stato prodotto e sono stati applicati quei parametri precedentemente ottimizzati nel protocollo manuale, come il rapport tra anticorpi, particelle e batteri, per generare un nuovo protocollo automatizzato per il dispositivo. L’effettivo funzionamento del dispositivo adepto a marcatore e concentratore è stato valutato e comparato con i risultati ottenuti dal protocollo manuale, verificando che il primo sia un possible sostituto del secondo. Il dispositivo microfluidico è stato testato con campioni addizionati a concentrazioni controllate e differenti, ovvero una soluzione buffer contenente il batterio bersaglio, e con campioni ospedalieri, che rappresentano tutta la complessità di una matrice reale. L’efficienza nel processare campioni addizionati è quantificata e una efficienza di cattura media del 86% ± 9% è ottenuta a concentrazioni di 2*10^5CFU/ml, mentre la concentrazioni minore rilevata con una differenza ragionevole tra positive e controllo negative è stata di 2*10^3CFU/ml. Il processamento dei campioni hanno offerto risultati limitati a causa di una alta variabilità nella concentrazione del campione ed al numero limitato di esperimenti, anche se un certo grado di cattura è stato evidenziato con promettenti risultati qualitative. Tutto il lavoro sperimentale nell’ambito di questa tesi è stato svolto presso i laboratori dell’ Instituto de Engenharia de Sistemas e Computadores – Microsistemas e Nanotecnologias INESC-MN, in collaborazione con l’Instituto Superior Técnico (IST), a Lisbona, Portogallo.