Diffractive oblique plane microscopy with UC2 toolbox

Oblique Plane Microscopy (OPM) is a cutting-edge type of Light Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM). OPM is characterized by all the advantages of LSFM, therefore it enables 3D imaging with high spatial and temporal resolution together with low photobleaching. However, OPM also solves some typical problems of LSFM, for instance the use of two objectives: one to illuminate the sample, the other to collect the fluorescent light. In fact, in OPM the sample is illuminated by a light sheet coming from the edge of an objective and the fluorescent light is collected by the same objective. As a consequence, it is possible to access the sample from one side only and use the microscopy slide as a sample holder. One of the disadvantages of OPM is that the illumination plane does not coincide with the focal plane of the objective, but rather they form an angle different from 0°. Therefore, particular techniques have to be devised to correct for aberrations on off-axis points and straighten the image plane. This master thesis has two main goals. The first goal is to understand the theory at the base of OPM and make it available to the research group. The second goal is to build a prototype of a type of oblique plane microscope called diffractive oblique plane microscope that uses a diffraction grating to straighten the image plane. The prototype is used to prove the working principle and to lay the basis to build the microscope with the UC2 toolbox invented within the research group.

Microscopia a illuminazione obliqua (Oblique Plane Microscopy, OPM) è un’emergente tecnica di microscopia a foglio di luce (Light Sheet Fluorescent Microscopy, LSFM). OPM possiede tutti i vantaggi di LSFM, quindi consente 3D imaging ad elevata risoluzione spaziale e temporale accompagnato da ridotto photobleaching. Tuttavia, OPM risolve anche alcuni problemi comuni in LSFM, ad esempio l’uso di due obiettivi: uno per illuminare il campione e uno per raccogliere la luce fluorescente. Infatti, in OPM il campione viene illuminato da un foglio di luce proveniente dal bordo di un obiettivo e la luce fluorescente è raccolta dallo stesso obiettivo. Di conseguenza, diventa possibile accedere al campione da un solo lato e preparare il campione sul tipico vetrino per microscopia. Uno degli svantaggi di OPM è che il piano di illuminazione e il piano focale dell’obiettivo non coincidono, ma piuttosto formano un angolo diverso da 0°. Quindi, particolari tecniche devono essere escogitate per eliminare l’aberrazione sui dettagli fuori fuoco e raddrizzare il piano dell’immagine. Questa tesi magistrale ha due principali obiettivi. Il primo consiste nel comprendere la teoria alla base di OPM per renderla nota al gruppo di ricerca. Il secondo obiettivo consiste nel riprodurre un prototipo di un tipo di microscopio a illuminazione obliqua chiamato Diffractive Oblique Plane Microscope che sfrutta un reticolo di diffrazione per raddrizzare il piano dell’immagine. Il prototipo è utilizzato per provare il principio di funzionamento e mettere le basi per costruire il microscopio con il toolbox UC2 ideato nel gruppo di ricerca.