Characterization of a family of bioplastics : bacterial polyhydroxyalkanoates

While a more and more globalized and connected society constantly seeks an increasing amount of energy and resources to sustain its indefinite growth, the pressure on earth’s ecosystems rapidly increases. The progressive acknowledgment of what the earth's boundaries are is gradually favoring a shift toward more integrated and sustainable management of resources. In this context, the application of new technologies and methods to the wastewater treatment plants in an optic of biorefinery could lead to a full valorization of the by-products leading to a lower environmental impact and new economic perspectives. The innovation proposed by this work, within the framework of the project “Wast4Bioplast - turning waste into viable bioplastics” funded by Fondazione Cariplo, is to demonstrate the feasibility of producing high-quality bioplastics from wastewater while reducing the overall costs and impacts for wastewater treatment plants. In this work, microbial PHAs obtained from a pilot plant have been studied as possible materials for bioplastics production. In particular, a comprehensive characterization was carried out to identify the properties variation of the produced biopolymers with the accumulation conditions. For the tested microbial PHAs, it was possible to highlight the best accumulation conditions according to the investigated properties. Possible attractive characteristics that could be exploited in commercial applications were pointed out, also focusing on the limits of the materials. The characterization study involved compositional and microstructural analyses by hydrogen-1 and carbon-13 nuclear magnetic resonance, molecular weight measurements by gel permeation chromatography, and viscometry in dilute solution. The surface hydrophobicity and morphology were investigated by optical contact angle measurements, optical microscopy, and atomic force microscopy. Differential scanning calorimetry was carried out for thermal analyses. In addition, an advanced nano-mechanical characterization was performed by atomic force microscope nanoindentation test. In addition, PHAs blends with a commercial polylactic acid (PLA), a commonly used biopolymer, were produced and studied to investigate the possible tuning of the properties. It was found that the carbon feeds used in the accumulation procedure could be specifically selected to tune the PHA-rich biomass composition. Nuclear magnetic resonance revealed that the produced biopolymers were blends of copolymers of poly(3-hydroxybutirate-co-3-hydrovalerate) (PHBV), with an average content of hydroxyvalerate units ranging from 2mol% to 74mol%, according to the carbon feed. The PHAs, that were extracted by means of chloroform, showed high molecular weights (above 100’000 Da) and, after a solvent/non-solvent fractionation, interesting thermal and nano-mechanical properties were observed. In particular, the sample of P(3HB-co-88% 3HV) was successfully isolated and characterized. It evidenced a weight average molecular weight of 279’000 Da, with a polydispersity index of 1.34. Thermal analyses evidenced a melting temperate of 106°C, which allows the polymer processability without excessive degradation, and Young’s modulus, extrapolated by atomic force microscopy nanoindentation tests, of 708 ± 78 MPa. Such results open up the possibility of further studying PHA, which properties can be tuned as a polyethylene-like material, to use it as a valid bioplastic, alternative to conventional fossil-based plastics.

Con una società sempre più globalizzata e connessa, alla perenne ricerca di una crescente quantità di energia e risorse per sostenere la sua crescita senza fine, la pressione sugli ecosistemi terrestri si fa sempre più insostenibile. La progressiva constatazione dell’esistenza di limiti intrinseci nel pianeta terra sta lentamente alimentando una transizione verso una gestione delle risorse sempre più integrata e sostenibile. In questo contesto, l’applicazione di nuove tecnologie e metodi agli impianti di trattamento delle acque reflue in un’ottica di bioraffineria potrebbe condurre alla valorizzazione dei sottoprodotti di processo, con una conseguente riduzione dell’impatto ambientale e nuove prospettive economiche. Questo studio si pone all’interno del progetto “Wast4Bioplast - turning waste into viable bioplastics” finanziato da Fondazione Cariplo, e mira a dimostrate la possibilità di produrre bioplastiche dai fanghi provenienti dal trattamento delle acque reflue, riducendo così i costi e l’impatto degli impianti di trattamento. In questo studio, PHA ottenuti da un impianto pilota sono stati studiati come possibile materiale per la produzione di bioplastiche. In particolare, è stata svolta una caratterizzazione al fine di definire la variazione delle proprietà dei biopolimeri in funzione delle condizioni di accumulo selezionate. Per i PHA testati, è stato possibile definire le condizioni di accumulo migliori in base alle caratteristiche riportate dal materiale. Inoltre, le prove condotte hanno messo in luce le proprietà interessanti per eventuali applicazioni commerciali della bioplastica, ponendo attenzione anche agli attuali limiti del materiale. La caratterizzazione effettuata sui PHA ha incluso l’analisi composizionale e microstrutturale, mediante tecnica spettroscopica di risonanza nucleare magnetica sia dell’idrogeno-1 sia del carbonio-13. La misura dei pesi molecolari è stata svolta con cromatografia a permeazione di gel e viscosimetria in soluzione diluita. Le caratteristiche di idrofobicità dei PHA sono state discusse registrando l’angolo di contatto con la tecnica della goccia sessile, mentre la morfologia superficiale è stata osservata con mediante microscopia ottica e microscopia a forza atomica, a diversi livelli di ingrandimento. La calorimetria a scansione differenziale è stata utilizzata per le analisi termiche del materiale, permettendo di identificare le temperature caratteristiche, ottenere una stima del grado di cristallinità, e delineare in maniera qualitativa la cinetica di cristallizzazione dei PHA in funzione della composizione. Inoltre, prove di nanoindentazione effettuate con microscopio a forza atomica hanno consentito di avere informazioni sulle proprietà elastiche nano-meccaniche, mediante l’estrapolazione del modulo di Young. Infine, sono stati prodotti blend di PHA e acido polilattico (PLA) con l’obiettivo di studiare la possibilità di regolare le proprietà del materiale in funzione del contenuto relativo dei due costituenti. Comunque, le analisi termiche hanno mostrato scarsa miscibilità dei costituenti. È stato evidenziato come l’impiego di diversi nutrimenti (acido acetico (HAc) e acido propionico (HPr)), e in differenti rapporti relativi (100:0, 60:40, 50:50, 30:70 HAc:HPr), durante la fase di accumulo del PHA nella biomassa, possa alterare la composizione del biopolimero risultante. Infatti, le analisi composizionali mediante risonanza nucleare magnetica dell’idrogeno-1 hanno riportato che i batch di biopolimero erano copolimeri di poliidrossibutirrato-co-idrossivalerato (PHBV), con un contenuto medio di unità di idrossivalerato variabile da 2% a 74% in moli, in funzione del nutrimento utilizzato. L’analisi microstrutturale, effettuata con risonanza nucleare magnetica del carbonio-13, ha messo in luce che i batch ottenuti erano miscele eterogenee costituite da domini di PHBV aventi deversi contenuti di unità di idrossivalerato. I PHA, ottenuti dalla biomassa per estrazione chimica con solvente, e nello specifico cloroformio, hanno riportato pesi molecolari elevati (maggiori di 100'000 Da) e distribuzione dei pesi molecolari medio-stretta (indice di polidispersione medio pari a 1.75) tramite cromatografia a permeazione di gel. Le analisi superficiali con misura dell’angolo di contatto hanno confermato il comportamento moderatamente idrofobico che caratterizza i PHA. Inoltre, è stata rilevata una dipendenza di tale caratteristica dalla composizione chimica: il diverso contenuto di unità di idrossivalerato nei copolimeri ha portato ad una variazione dell’angolo di contatto. Al contrario, non è stata osservata una variazione della morfologia superficiale alle scale indagate per i diversi batch di PHA. Questi, infatti, hanno evidenziato due morfologie caratteristiche entrambi aventi una superficie rugosa, in maniera indipendente dalla composizione. Le analisi termiche e nano-meccaniche hanno messo in risalto le diverse proprietà dei PHA con un limitato contenuto di idrossivalerato, ottenuti con un nutrimento di solo HAc, rispetto agli altri batch. Quest’ultimi, essendo costituiti da molteplici domini di PHBV, hanno infatti evidenziato proprietà termiche ed elastiche simili. A titolo di esempio, in sono riportati i moduli di Young estrapolati dalle curve forza-distanza ottenute dai test di nanoindentazione con microscopio a forza atomica. Tali confronti hanno evidenziato la necessità di isolare i singoli domini presenti nelle miscele eterogenee dei batch di PHA estratti, al fine di caratterizzare dei PHBV con maggior controllo composizionale. Un frazionamento solvente/non-solvente è stato impiegato a tale scopo per un batch specifico. Questo processo ha confermato la presenza all’interno del singolo batch di molteplici frazioni di PHBV, la cui composizione era differente rispetto al contenuto medio di idrossivalerato misurato con risonanza magnetica nucleare dell’idrogeno-1. In particolare, è stata isolata una frazione con proprietà promettenti dal punto di vista applicativo, con possibilità di superare alcuni dei principali limiti che caratterizzano il polimero di poliidrossibutirrato (PHB). Il copolimero ha mostrato essere costituito da 88% in moli di unità di idrossivalerato. L’analisi spettroscopica di risonanza magnetica nucleare del C-13 ha suggerito la presenza di lunghe sequenze di unità di idrossivalerato in catena, con una microstruttura a blocchi. La cromatografia a permeazione di gel ha riportato un peso molecolare medio ponderale di 279'000 Da, con un indice di polidispersione pari a 1.34. La temperatura di fusione di questo copolimero semi-cristallino è risultata essere pari a 106 °C. Tale valore consentirebbe un’agevole processabilità del materiale, evitando degradazione termo-ossidativa, tipicamente in atto a temperature maggiori dei 170 °C. Per questo campione, la caratterizzazione nano-meccanica mediante microscopio a forza atomica ha evidenziato un modulo di Young pari a 708 ± 78 MPa dopo 7 giorni dalla deposizione per spin coating in forma di film sottile. Questa riduzione del modulo elastico, rispetto al copolimero puro di PHB, è da intendersi positivamente. Concludendo, le proprietà mostrate da alcuni PHBV sono risultate promettenti per eventuali future applicazioni nel mercato come bioplastica alternativa a plastiche prodotte da fonti fossili. Infatti, modificando il contenuto di idrossivalerato nel copolimero, è stato possibile alterare le caratteristiche del PHB, ottenendo un materiale le cui proprietà indagate richiamano quelle del polietilene.