Studio, progettazione, sviluppo e caratterizzazione di un sonicatore ad ultrasuoni miniaturizzato per lisi cellulare

The purpose of this thesis was to create and develop an ultrasonic sonicator capable of lysing yeast cells to increase the efficiency of EASY (Extraction and Analysis System), an automatic nucleic acid extractor developed by STMicroelectronics. Molecular diagnostics is the set of laboratory techniques that exploits genomic knowledge for studying nucleic acids, in order to carry out investigations in the medical field. Any genetic investigation requires a first step of DNA / RNA purification. It is then possible to move on to the analysis of the nucleic acid which can require various stages of multiplication and finally to the detection of the genetic material of interest. The Polymerase Chain Reaction (PCR) has established itself over the years as the technique of choice for amplification and detection of DNA / RNA. Recently, it is increasingly required to carry out all these analysis processes, called sample-to-answer flow, next to the patient or in conditions of absence of specialized personnel. The development of innovative Lab on a chip (LOC) devices that integrate all the phases of an experimental procedure that is typically carried out in the laboratory on a single chip, has led to this point of care scenario. STMicroelectronics, a leading company in the semiconductor field, is developing a sample-to-answer point-of-care system with applications in the field of molecular diagnostics. The goal is to integrate both the nucleic acid extraction phase and its amplification and detection through real-time PCR in a single instrument. Currently this integration phase has not yet been reached but there are two different devices: the EASY and the Q3. The first is still in the prototype phase while the second is already a commercial product. This thesis therefore contributes in part to the development and improvement of the nucleic acid extraction device. The goal in particular is to increase the efficiency of the lysis made by the prototype by means of chemical reagents. This type of cell membrane rupture mechanism is quite slow and therefore not suitable for a sample-to-answer point-of-care device. After studying the structure and functioning of the Automatic Nucleic Acid Extractor (EASY), I focused on research and analysis of ultrasonic cavitation and its effects in the cellular field. In this way I analyzed how ultrasonic waves can generate cavitational bubbles whose implosion causes cell membranes to rupture. After studying the state of the art in the literature, I focused on the implementation of a small-sized sonicator capable of lysing a sample of yeast cells. I analyzed the frequency response of piezoelectric transducers which by size were suitable for the final goal of the work. I carried out various experiments to study how the frequency response varies according to the different working conditions to which the device under test is subjected. Based on these data and on the literature, I hypothesized various operating points in which to perform the ultrasonic sonication of the biological sample under examination. I then carried out various experiments to identify the optimal conditions for achieving good cell lysis. I evaluated the experimental results using a spectrophotometer and a microscope analysis. To obtain these experimental results I used a rather cumbersome setup that consists of a bench power supply and various electronic boards. Since the objective of this is to create a miniaturized sonicator to be integrated with the EASY device, I have designed a single board capable of performing the same functions.

Lo scopo di questa tesi è realizzare e sviluppare un sonicatore ultrasonico in grado di lisare cellule di lievito per aumentare l'efficienza dell'EASY (Extraction and Analysis System), estrattore automatico di acidi nucleici sviluppato da STMicroelectronics. La diagnostica molecolare è l'insieme delle tecniche di laboratorio che sfruttano le conoscenze genomiche per lo studio degli acidi nucleici con l'obiettivo di effettuare indagini in campo medico. Qualunque indagine genetica richiede un primo passaggio di purificazione del DNA/RNA. Si può poi passare all'analisi dell'acido nucleico che può prevedere varie fasi di moltiplicazione e infine alla rilevazione del materiale genetico d'interesse. La Polymerase Chain Reaction (PCR) si afferma negli anni come tecnica d'elezione per l'amplificazione e rilevazione del DNA/RNA. Negli anni viene sempre più spesso richiesta l'esecuzione dell'insieme di tali processi di analisi, definito flusso sample-to-answer, accanto al paziente o in condizioni di assenza di personale specializzato. Lo sviluppo dei Lab on a chip (LOC) dispositivi innovativi che integrano su un unico chip tutte le fasi di una procedura sperimentale che viene tipicamente svolta in laboratorio, ha permesso di condurre a questo scenario point of care. STMicroelectronics, azienda leader nella microelettronica, sta sviluppando un sistema point-of-care sample-to-answer con applicazioni in campo della diagnostica molecolare. L'obiettivo è quello di integrare in un unico strumento sia la fase di estrazione di acidi nucleici, sia la sua amplificazione e rilevazione tramite real-time PCR. Attualmente non si è ancora raggiunta questa fase di integrazione ma si hanno due dispositivi differenti: l'EASY e il Q3. Il primo è ancora in fase prototipale mentre il secondo è già in fase di produzione. Questa tesi va quindi a contribuire in parte allo sviluppo e al miglioramento del dispositivo per estrazioni di acidi nucleici. L'obiettivo in particolare è quello di aumentare l'efficienza della lisi effettuata dal prototipo per mezzo di reagenti chimici. Questo tipo di meccanismo di rottura delle membrane cellulare è abbastanza lento e non adatto dunque ad un dispositivo point-of-care sample-to-answer. Dopo aver studiato la struttura e il funzionamento dell'estrattore automatico di acidi nucleici (EASY), mi sono focalizzata sulla ricerca e l'analisi della cavitazione ultrasonica e dei suoi effetti in ambito cellulare. In questo modo ho analizzato come le onde ultrasoniche possono generare bolle cavitazionali la cui implosione provoca la rottura delle membrane cellulari. Dopo aver studiato lo stato dell'arte in letteratura mi sono concentrata nell'implementazione di un sonicatore di piccole dimensioni in grado di effettuare la lisi di un campione di cellule di lievito. Ho analizzato la risposta in frequenza di attuatori piezoelettrici che per dimensione risultavano idonei per l'obiettivo finale del lavoro. Ho realizzato vari esperimenti per studiare come la risposta in frequenza varia in funzione delle diverse condizioni di lavoro a cui viene sottoposto il piezoelettrico. Basandomi su tali dati e sulla letteratura ho ipotizzato vari punti di lavoro in cui eseguire la sonicazione ultrasonica del campione biologico in esame. Ho quindi effettuato vari esperimenti per identificare le condizioni ottimali per ottenere una buona lisi cellulare. Ho valutato i risultati sperimentali sia utilizzando uno spettrofotometro che tramite un'analisi al microscopio. Per ottenere questi risultati sperimentali ho utilizzato un setup piuttosto ingombrante poiché costituito da un alimentatore da banco e varie schede elettroniche. Dato che l'obiettivo di questa tesi è quello di realizzare un sonicatore miniaturizzato da integrare al dispositivo EASY, ho progettato una board unica in grado di svolgere le stesse funzioni.