Surface functionalization of clear aligners with transparent antimicrobial coating

Transparent dental aligners, including those produced by AirNivol S.p.A., with which the author of the present thesis has a collaboration, are an innovation in the orthodontic sector. Their purpose is to align the teeth in their most correct position, with the least dis-comfort and the greatest aesthetics. The realization of the transparent aligners is divided into two phases: design and production. The orthodontist acquires the impression of the patient's teeth, which is used to create a digital model of the dental crown and gum. The treatment plan consists of generating a sequence of tooth movements until the optimal position is reached. Each movement is associated with a reference model that is 3D printed and used to thermoform the aligner using polyethylene terephthalate glycol (PET-G) discs. Each aligner must be worn by the patient for two weeks, and for at least 22 hours a day, removing it only during dental cleaning and during meals. The aligners have many positive aspects, such as comfort, transparency, the fact that they are removable, and that they do not alter the speech. On the other hand, a negative aspect is the increase in diseases of the oral cavity linked to a greater bacterial proliferation caused by a complete covering of the dental surface with consequent absence of the action of salivary flow and an increase in bacterial density below the devices. The aim of this thesis is to functionalize the surface of the aligner through a coating with release of an antibacterial agent, no bacterial-repelling, as the removal of bacteria on the surface of the aligner is carried out by the patient himself during the cleaning of the oral cavity. The studied coating is formed by a matrix, titanium dioxide (TiO2) an inorganic material, easily available and deposited at low temperatures through the sol-gel dip-coating technique, and by an antibacterial agent, silver, capable of being released in water solution. The salt, silver nitrate (AgNO3), is used as a source of the silver ions, Ag+, which are responsible for the antibacterial action of the silver. The dissociation of silver nitrate into Ag+ and NO3- occurs in a water solution. The synthesis of the titanium dioxide sol-gel, TiO2, involves the mixing of distilled water, nitric acid, formic acid and TTIP (Titanium isopropoxide). The silver nitrate is added to the starting solution in a molar concentration of 0,01 M. This value is called MIC (minimum Inhibitory Concentration). It was important to determine a concentration value that was not toxic for the patient but effective in inhibiting bacterial proliferation. Different types of samples were prepared according to the type of analysis to be performed. Some samples were prepared with the deposition of a primer, a coupling agent, in order to increase the adhesion between an organic substrate and an inorganic coating. The selected silane is 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES). After the deposition the TiO2 deposition follows. The tests carried out for the morphological, physical, and chemical characterization are respectively SEM/EDS, FTIR-ATR, and ICP-EOS. Furthermore, surface wettability measurements were performed by contact angle. The tests carried out concerning the mechanical characterization, for the verification of the stability and estimation of the adhesion of the coating to its substrate are the nano-indentation, tape test, brushing tests for six consecutive minutes, stability in artificial saliva (solution of distilled water and inorganic salts) and stability over time. All these tests were performed both on samples treated with TiO2 coating only and with APTES-TiO2. On the other hand, direct antibacterial and indirect tests for the evaluation of the cytotoxicity of the coating were carried out only on samples coated with TiO2. The antibacterial tests were performed on E. Coli (Gram -) and S. Aureus (Gram +) for 24 hours, while the cytotoxic tests on murine adipose tissue L929 fibroblasts for 14 days. The results obtained from the SEM /EDS analysis show a lack of uniformity of the coating and the presence of cracks in the areas where the coating is present. FTIR-ATR analyses, carried out to determine the presence of possible bonds between primer and substrate and between primer and TiO2 coating, do not show any change in the intensity of the peaks or in the formation of new peaks, between the control sample, i.e. without coating, and those treated. The ICP-EOS analyses show an almost total release of the antibacterial agent, Ag+, in the first 24 hours of approximately 97%, both in the case of samples treated with TiO2 only and in those treated with both, primer and coating. The stability test carried out with brushing for six consecutive minutes (simulation of cleaning the aligner during a day) showed an almost total detachment of the coating in the case of TiO2, while in the case of silane there is a higher concentration of the coating. Unfortunately, the concentration and the area in which the coating is deposited are very variable. Therefore, a real quantification of the concentration after the treatment is not possible, as it is not possible to carry out a SEM/EDS analysis before brushing. The stability tests in artificial saliva were successful but also in this case a real quantification before and after was not feasible. The nano-indentation tests did not produce applicable results, as did the tape test analyses. The antibacterial and cytotoxic tests both gave positive results: the first showed an efficacy of 90% while the second showed a cell viability above the 85% threshold value, as indicated in the ISO 10993-12:2004 standard. In conclusion, the coating is transparent as required, but an improvement in the adhesion between coating and substrate is necessary in order to ensure the stability of the coating during use. Furthermore, by releasing the antimicrobial agent too quickly, the coating loses its effectiveness after only one day of use. A different matrix or reversible bonds between matrix and antibacterial agent may be needed to avoid uncontrolled release. The silver applied as an antibacterial agent performs its function, but further analyses will be necessary to calculate the correct MIC value for which the action of the antibacterial agent is effective in the specific case of bacteria in the oral cavity.

Gli allineatori dentali trasparenti, tra cui quelli prodotti da AirNivol S.p.A., con cui l’autrice della presente tesi ha collaborato, sono una innovazione nel settore dell’ortodonzia. Il loro scopo è quello di allineare i denti nella loro posizione più corretta, con il minor dis-confort e maggior estetica possibili. La realizzazione degli allineatori trasparenti si divide in due fasi: progettazione e produzione. L’ortodontista acquisisce l’impronta della dentatura del paziente, che viene utilizzata per realizzare un modello digitale della corona dentale e della gengiva. Il piano di trattamento consiste nella generazione di una sequenza di movimenti dei denti, fino al raggiungimento della posizione ottimale. A ciascun movimento è associato un modello di riferimento che viene stampato in 3D, ed utilizzato per termoformare l’allineatore utilizzando dischi di Polyethylene terephthalate glycol (PET-G). Ogni allineatore deve essere indossato dal paziente per due settimane, e per almeno 22 ore al giorno, con la possibilità di rimuoverlo durante la pulizia dentale e durante i pasti. Molteplici sono gli aspetti positivi degli allineatori, quali il confort, la trasparenza, il fatto che siano rimovibili, e che non alterino il parlato. Di contro, un aspetto negativo è l’aumento delle malattie del cavo orale legate ad una maggiore proliferazione batterica causata da una completa copertura della superficie dentale dall’allineatore con conseguente assenza dell’azione del flusso salivare ed aumento della densità batterica al di sotto di tali dispositivi. Lo scopo della presente tesi è quello di funzionalizzare la superficie dell’allineatore con un rivestimento a rilascio di agente antibatterico, non a repulsione batterica, in quanto la rimozione dei batteri adesi sulla superficie dell’allineatore viene effettuata dal paziente stesso in fase di pulizia del cavo orale. Il coating studiato è formato da una matrice, biossido di titano (TiO2), un materiale inorganico, facilmente reperibile e depositabile a basse temperature tramite tecnica sol-gel dip-coating, e da un agente antibatterico, l’argento, in grado di essere rilasciato in soluzione acquosa. Il sale, argento nitrato (AgNO3), viene utilizzato come fonte degli ioni argento, Ag+, i veri responsabili dell’azione antibatterica dell’argento stesso. La dissociazione dell’argento nitrato in Ag+ e NO3- avviene in soluzione acquosa. La sintesi del sol-gel di biossido di titanio, TiO2, prevede la miscelazione di acqua distillata, acido nitrico, acido formico e TTIP (Isopropossido di titanio). L’ argento nitrato viene aggiunto alla soluzione di partenza in una concentrazione molare di 0,01 M. Tale valore è chiamato MIC (minimum inhibitory concentration). Importante è stato determinare un valore di concentrazione non tossico per il paziente ma efficace nell’inibire la proliferazione batterica. Diversi tipi di campioni sono stati preparati in base al tipo di analisi da effettuare. Alcuni campioni sono stati preparati con la deposizione di un primer, un agente di accoppiamento, in modo da aumentare l’adesione tra un substrato organico ed un coating inorganico. Il silano scelto è il 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES). Dopo la sua deposizione segue quella del TiO2. I test effettuati per la caratterizzazione morfologica, fisica e chimica sono rispettivamente SEM/EDS, FTIR-ATR e ICP-EOS. Inoltre, sono state eseguite misure di bagnabilità della superficie tramite angolo di contatto. I test effettuati invece per la caratterizzazione meccanica, per la verifica della stabilità e stima dell’adesione del coating al substrato del coating sono la nano-indentazione, tape test, prove di spazzolamento per 6 minuti consecutivi, stabilità in saliva artificiale (soluzione di acqua distillata e sali inorganici) e stabilità nel tempo. Tutti questi test sono stati effettuati sia sui campioni trattati con solo coating di TiO2 che con APTES-TiO2. Invece i test diretti antibatterici e quelli indiretti per la valutazione della citotossicità del coating sono stati effettuati solo su campioni rivestiti da TiO2. I test antibatterici sono stati effettuati su E. Coli (Gram -) e S. Aureus (Gram +) per 24 ore, mentre quelli citotossici sui fibroblasti L929 di tessuto adiposo murino per 14 giorni. I risultati ottenuti dall’analisi SEM/EDS mostrano una mancata uniformità del coating e presenza di cricche nelle zone in cui il coating è presente. Le analisi FTIR-ATR, svolte per determinare la presenza di possibili legami tra primer e substrato e tra primer e coating di TiO2, non mostrano alcun cambiamento nell’intensità dei picchi o nella formazione di nuovi picchi, tra il campione di controllo, ovvero privo di coating, e quelli trattati. Le analisi ICP-EOS mostrano un rilascio quasi totale dell’agente antibatterico, Ag+, nelle prime 24 ore di circa il 97%, sia nel caso di campioni trattati con solo TiO2 che in quelli trattati con entrambi, primer e coating. La prova di stabilità effettuata con lo spazzolamento per 6 minuti consecutivi (simulazione di un giorno di pulizia dell’allineatore) ha mostrato un distacco quasi totale del coating nel caso di TiO2, mentre nel caso del silano è ancora presente parte coating. Purtroppo, la concentrazione e la zona in cui il coating viene deposto sono molto variabili, quindi una quantificazione vera e propria della concentrazione dopo il trattamento non è possibile, in quanto non è possibile effettuare un’analisi SEM/EDS prima dello spazzolamento. Le prove di stabilità in saliva artificiale hanno avuto esito positivo ma anche in questo caso una quantificazione vera e propria del prima e del dopo non è risultata fattibile. Le prove di nano-indentazione non hanno prodotto risultati applicabili, così come le analisi di tape test. I test antibatterici e quelli citotossici hanno dato entrambi esito positivo: i primi un’efficacia del 90% mentre i secondi mostrano una vitalità cellulare sopra il valore soglia dell’85%, come indicato nello standard ISO 10993-12: 2004. In conclusione, il coating risulta essere trasparente come richiesto ma un perfezionamento nell’adesione tra coating e substrato risulta essere necessaria in modo da garantire la stabilità del rivestimento durante l’utilizzo. Inoltre, il coating rilasciando troppo velocemente l’agente antimicrobico, perde la sua efficacia dopo un solo giorno di utilizzo. Una matrice diversa o dei legami reversibili tra matrice e agente antibatterico potrebbero essere necessari per evitare un rilascio incontrollato. L’argento applicato come agente antibatterico svolge la sua funzione, ma ulteriori analisi saranno necessarie per calcolare il corretto valore di MIC per cui l’azione dell’agente antibatterico è effettiva nel caso specifico dei batteri nel cavo orale.