Design and optimisation of two bioreactors for perfusion of 3D humanised, immunocompetent liver disease models

The progressively increasing incidence and mortality rate of liver disease is constituting a serious challenge in terms of global healthy. Therefore, innovative treatments are urgently needed. In order to develop effective therapeutic strategies, reliable models are extremely important in order to recapitulate liver physiological and pathological aspects. Up to date, several in vivo (animal) and in vitro models are employed, however they are both hampered by unreliable outcomes. In this scenario the combination of human-derived ex-vivo models with tissue engineering strategies, appears as a promising strategy to reproduce liver pathophysiology. The main aim of the thesis concerned the design and development of two bioreactor-based approaches to sustain the dynamic culture of liver ex vivo models represented by Precision Cut Liver Slices (PCLSs) and bioengineered constructs based on decellularized matrix. By supporting the dynamic culture, PCLSs demonstrated enhanced cellular viability and lower apoptotic levels, when compared to the standard condition (i.e., carbogen culture). Furthermore, the same developed bioreactor demonstrated the ability to maintain immune cell viability (Peripheral Blood Mononuclear Cells – PBMCs) over time in culture. Another bioreactor was developed to support the confined perfusion of bioengineered constructs composed by decellularized matrices. In this way the bioreactor-based approach supported the culture of the constructs, as demonstrated by the presence of cells (i.e., Hepatic Stellate Cells) for all the analysed timepoints. However, the system needs a further optimisation to perform PBMCs dynamic culture. The present work describes promising results for the establishment of the culture of immuneperfused ex vivo models, able to recapitulate important features of liver physiology and disease.

Il progressivo incremento nei casi e tasso di mortalità per quanto riguarda patologie epatiche, rappresenta una seria sfida a livello di sanità mondiale. Pertanto, vi è un urgente necessità di sviluppare nuovi trattamenti. Per sviluppare delle strategie terapeutiche efficaci, sono necessari dei modelli affidabili, capaci di riprodurre aspetti fisiologici e patologici del fegato. Diversi tipi di modelli in vivo (animali) ed in vitro sono attualmente impiegati ma hanno dimostrato risultati inaffidabili. In questo contesto, la combinazione di modelli ex vivo di origine umana e strategie di ingegneria tissutale appare come un promettente approccio per riprodurre le caratteristiche patofisiologiche del fegato. Il principale scopo della presente tesi riguarda la progettazione e sviluppo di due bioreattori per sostenere la coltura dinamica di modelli ex vivo di tessuto epatico rappresentati da Precision Cut Liver Slices (PCLSs) e costrutti bioingegnerizzati basati su matrici decellularizzate. Supportate dalla condizione di coltura dinamica, le PCLSs hanno dimostrato una maggiore vitalità ed una minore attività apoptotica nei confronti della condizione di coltura di riferimento (coltura in atmosfera di carbogeno). Inoltre, lo stesso bioreattore ha dimostrato l’abilità di supportare la coltura dinamica di cellule immunitarie (cellule mononucleari derivate da sangue periferico – PBMCs) mantenendo elevata vitalità. Un altro bioreattore è stato sviluppato per sostenere la coltura di costrutti bioingegnerizzati derivati da matrici decellularizzate, implementando la condizione di perfusione confinata. In questo modo, l’approccio basato sul bioreattore si è dimostrato utile nel sostenere la coltura dei costrutti, come dimostrato dalla presenza di cellule (cellule stellate epatiche – HSCs) rilevate in tutti gli intervalli di indagine. Tuttavia, tale sistema richiede un ulteriore ottimizzazione per permettere la coltura dinamica di cellule immunitarie. Il presente lavoro descrive risultati promettenti per la definizione di modelli ex vivo immunoperfusi, capaci di poter riprodurre importanti caratteristiche fisiologiche e patologiche del fegato.