Morphometric characterization and micro-finite element analysis on distal femur and proximal tibia of ovariectomized and sham-operated mice

Osteoporosis is a systemic skeletal disease caused by a disproportion between osteoclast and osteoblast activity with consequent predominance of bone resorption. It provokes weakening and loss of bone mass and it affects especially the trabecular bone, which experiences the reduction and the thinning of its trabeculae. This pathology is widely spread in elderly population and in postmenopausal women, exposing them to a higher risk of fragility fracture especially of hip, spine and wrist. The animal model considered suitable for investigating human osteoporosis is the ovariectomized murine model in which bone deterioration occurs after being submitted to the ovary removal surgery. This model is appropriate to investigate the consequent hormonal changes caused by the surgery and therefore the decline in bone quantity and quality. However, the mechanism occurring in murine models cannot be directly compared to the one experienced by postmenopausal women since menopause is an aged phase of natural bone decline, which is a far cry from the induced bone deterioration in ovariectomized mice. The aim of this work is to evaluate if the estrogen depletion -- caused by ovariectomy -- provokes significant bone decline in structural and mechanical properties in ovariectomized mice with respect to the sham-operated ones that are mice in which the surgical procedure is reproduced without the ovary removal. In this study, eight outbred CD1 female mice underwent an ovariectomy (OVX) or sham (SHAM) surgery at 22-26 weeks of age and then, after 8 weeks, they were sacrificed. Distal femur and proximal tibia are the anatomic regions, scanned and provided by Elettra Sincrotrone Trieste, that will be thoroughly investigated. The cortical and trabecular bone microarchitecture of each sample was deeply studied and then statistical analyses were performed on the computed bone morphometric parameters. The aim of the first part of this study was to establish if morphometric analyses of the micro-CT reconstruction performed on all samples allowed to cluster the samples in the two categories of SHAM and OVX. For this reason, a blind analysis where it was not known to which group each sample belonged to, was performed on the whole dataset and two possible subdivisions, chosen according to two different statistical results, were suggested. Once known the effective subdivision which did not completely match the proposed ones, significant parameters able to validate the real subdivision between ovariectomized and sham operated samples were sought. The information concerning bone mineral content was studied through a histogram analysis with the aim to investigate the position of the grey values peaks -- which is somewhat related to the energy attenuation and therefore to tissue density -- of the two categories of SHAM and OVX. Micro finite element analysis was performed on each sample simulating a torsion in rotation control. Mechanical properties, such as ultimate torsional energy, torsional rigidity and its components -- shear modulus and polar moment of inertia -- were extracted and then compared among the two categories of SHAM and OVX. The results of this study demonstrated that no statistical difference in morphometric mechanical properties emerged from the two groups; however, the dependence of bone morphometry and mechanical properties on different long bone sites was proved. Cortical thickness increases, while total cross-sectional area decreases approaching the metaphysis along the longitudinal axis of long bones. These changes in geometry affect the torsional rigidity, whose values increase approaching the most proximal sites of tibia and the most distal areas of femur. Furthermore, this work highlighted the crucial relevance of the age at which mice are sacrificed: pre-existing works present in literature demonstrate how structural properties vary referring to growing ages, by virtue of changes of both cross sectional geometry and material properties. The rapid growth phase of mice skeleton was experienced in the first months of age and most of the structural parameters sharply increased, then, they reached a stable value once bone skeletal maturity was achieved. Moreover, trabecular bone was deeply influenced by age since its decline begins at a relatively young age in the metaphyseal regions of long bones and continues into older age, and this is clearly witnessed by the paucity of trabecular number in the trabecular VOI of the samples under study. The exiguous detected bone volume fraction makes it challenging to prove trabecular differences between SHAM and OVX samples since the long bones have already undergone significant bone loss due to aging. Moreover, it would be appropriate to investigate a much larger number of outbred CD1 mice to reduce the effect of their high inter-animal variability on the quantitative results. In conclusion, this study emphasizes the strict reliance of morphometric and mechanical properties on the specific region of long bones under investigation and the relevance to choose an adequate number of samples of the same age to perform this kind of investigation. Despite the limitations of this work, it offers an effective methodological approach to be able to perform a subsequent targeted study.

L'osteoporosi è una malattia sistemica dello scheletro, causata da uno squilibrio tra l'attività degli osteoclasti e quella degli osteoblasti, che provoca un maggior riassorbimento osseo. Essa è caratterizzata dall'indebolimento e dalla riduzione della massa ossea e colpisce prevalentemente l'osso trabecolare inducendo una riduzione e un assottigliamento delle sue trabecole. Questa malattia è largamente diffusa nella popolazione anziana e nelle donne in menopausa e predispone allo sviluppo di fratture da fragilità soprattutto all'anca, alla colonna vertebrale e al polso. Un modello animale indicato per studiare l'osteoporosi è quello del topo ovariectomizzato il quale sperimenta una riduzione ossea dopo l'intervento di asportazione chirurgica delle ovaie. Questo modello è ritenuto adatto per valutare i cambiamenti ormonali che si verificano a seguito dell'ovariectomia. Nonostante ciò, il meccanismo che si instaura nei modelli murini è diverso da quello che si sviluppa nelle donne in menopausa perchè la menopausa è un processo naturale legato all'età ed è ben lontano dal processo di riduzione ossea indotto dall'ovariectomia che invece sperimentano i topi. Lo scopo di questo lavoro è quello di valutare se la diminuzione di estrogeni -- causata dall'ovariectomia -- provoca una riduzione significativa delle proprietà morfometriche e meccaniche nell'osso dei topi ovariectomizzati rispetto agli sham, i quali sono sottoposti alla procedura chirurgica, ma senza la rimozione delle ovaie. Per questo studio, otto femmine di topo CD1 di 22-26 settimane sono state sottoposte o all'ovariectomia (OVX) o alla chirurgia sham (SHAM) e, dopo 8 settimane, sono state sacrificate. Le micro-CT di due regioni anatomiche (femore distale e tibia prossimale) di questi topi, fornite da Elettra Sincrotrone Trieste, vengono accuratamente studiate. La microarchitettura dell'osso trabecolare e di quello corticale relativa a ciascun campione viene accuratamente studiata e successivamente vengono eseguite delle analisi statistiche sui parametri morfometrici calcolati. L'obiettivo della prima parte di questo studio è di stabilire se le analisi morfometriche effettuate sulle ricostruzioni delle micro-CT di tutti i campioni permettessero di raggruppare i campioni nelle due distinte categorie di SHAM e OVX. Per questo motivo, un'analisi in cieco, in cui non è noto a quale gruppo un campione appartenga, viene eseguita sull'intero dataset e vengono proposte due possibili suddivisioni scelte sulla base dei risultati delle analisi statistiche svolte. Una volta nota la reale suddivisione la quale non corrisponde del tutto a nessuna delle due proposte, i parametri morfometrici calcolati relativi al raggruppamento corretto tra SHAM e OVX sono sottoposti a un test statistico. Non trovando differenze statistiche nella morfometria dell'osso, in seguito vengono indagati altri parametri per capire se invece questi sono in grado di validare l'effettiva suddivisione tra campioni ovariectomizzati e sham. Per questo, il contenuto minerale osseo viene studiato attraverso un'analisi degli istogrammi per i due gruppi (SHAM e OVX) valutando la posizione dei picchi dei valori di grigio che è in qualche modo legata all'energia di attenuazione e, quindi, alla densità del tessuto. Viene eseguita un'analisi ad elementi finiti su tutti i campioni simulando una torsione in controllo di rotazione. Le proprietà meccaniche, come l'energia torsionale ultima, la rigidezza torsionale e le sue componenti -- modulo di taglio e momento d'inerzia polare -- vengono calcolate e successivamente comparate tra i campioni SHAM e i campioni OVX. Dai risultati di questo studio non emerge nessuna differenza statistica nei parametri morfometrici e nelle proprietà meccaniche tra i due gruppi; comunque, viene rivelata una stretta dipendenza dei parametri morfometrici e delle proprietà meccaniche con le diverse regioni di ossa lunghe considerate. In particolare, avvicinandosi alla metafisi lungo l'asse longitudinale delle ossa lunghe lo spessore corticale aumenta, mentre l'area totale inclusa all'interno del periostio nella singola sezione diminuisce. Questi cambiamenti nella geometria si riflettono sulla rigidezza torsionale, i cui valori aumentano avvicinandosi alla parte più prossimale della tibia e alle aree più distali del femore. Questo lavoro vuole anche sottolineare l'importanza dell'età a cui i topi vengono sacrificati: precedenti studi presenti in letteratura dimostrano come le proprietà strutturali varino all'aumentare dell'età a causa di cambiamenti sia nella geometria della sezione trasversale sia nelle proprietà del materiale. Nei primi mesi di vita, i topi sperimentano una fase di crescita scheletrica rapida in cui la maggior parte dei parametri strutturali aumenta notevolmente e, una volta che viene raggiunta la maturità scheletrica tali parametri, si stabilizzano. Inoltre, l'osso trabecolare risulta fortemente influenzato dall'età, infatti il suo deterioramento inizia ad un'età relativamente giovane nella metafisi delle ossa lunghe e prosegue negli anni a seguire: la scarsità del numero di trabecole presente nel VOI trabecolare dei campioni studiati testimonia chiaramente tale declino dell'osso trabecolare. L'esigua frazione volumetrica dell'osso nei topi studiati rende complessa l'individuazione di differenze statistiche tra campioni SHAM e OVX poichè nelle ossa lunghe si è già verificata una significativa perdita ossea dovuta all'invecchiamento. Inoltre, sarebbe opportuno analizzare un numero molto più alto di topi outbred CD1 in modo da ridurre l'effetto della loro elevata variabilità inter-animale sui risultati quantitativi. In conclusione, questo studio evidenzia la stretta dipendenza delle proprietà morfometriche e meccaniche con la specifica regione delle ossa lunghe che è stata considerata, e l'importanza di scegliere un numero adeguato di campioni della stessa età da sottoporre a questa tipologia di studio. Malgrado le limitazioni, questo lavoro nel suo insieme offre un approccio metodologico efficace per poter eseguire uno studio mirato futuro.