Development of a novel bioreactor for cartilage tissue engineering

Cartilage is a supporting connective tissue that covers and protects the ends of long bones at the joints and it also has a structural support function for the nose, the ears, the bronchial tubes, the intervertebral discs and many other body components.[1] The aspect of cartilage that leads to the study of new innovative therapies of regenerative medicine is its poor ability to respond to the damages it undergoes, in fact, in the case of degenerative inflammatory disease or traumatic lesion, the tissue does not heal spontaneously.[1] This tissue is subject to very common degenerative inflammatory diseases such as osteoarthritis or rheumatic arthritis, as well as to traumatic lesions that may progressively cause degeneration of the tissue due to lack of cell renewal. In particular, Osteoarthritis (OA) is a chronic disease characterized by the deterioration of cartilage in the joints, around 300 million people worldwide suffer from OA, and it is considered the major cause of disability in adults, because it causes very strong pain, loss of joint function and a decrease in the quality of life of those who suffer this disease. [2, 3] The main goals of therapies for cartilage-related diseases today include minimizing joint pain and swelling, preventing deformity (such as ulnar deviation) and radiographic damage (such as erosions), maintaining quality of life (personal and work), and controlling extra-articular manifestations. If drugs, like anti-inflammatory or antirheumatic, are not enough the main cartilage repair strategies includes debridement, bone marrow stimulation, cell-based and cell plus scaffold-based, whole-tissue transplantation techniques and joint replacement [4]. These techniques try to compensate for the poor regenerative capacity of cartilage by promoting the colonization of the damaged site by cells capable of regenerating the tissue. The techniques used today, however, face serious complications, for example the neoformed tissue does not have mechanical characteristics like the native one, some techniques require the removal of a part of tissue from a less charged area for implantation in the damaged site, causing morbidity in the donor site. In addition, other limits are, for example, the limited amount of implants that can be harvested, or, if a prosthesis is used, in extreme cases for total tissue replacement, it may cause an external body reaction in the patient or there would be a need for a new surgical operation in case of implant failure which would be much more complex and risky than the first operation. To overcome these complications, innovative techniques have been developed that use a strategy based on tissue engineering. Tissue engineering is defined as that interdisciplinary field which applies the principles and methods of engineering and life sciences in order to develop biological substitutes for maintenance, repair, replacement or functional enhancement of biological tissues or entire organs.[5] The aim of the thesis was to create a bioreactor capable of applying a hydraulically-driven compressive stimulation exploiting the deformation of a silicone membrane where a construct, which consist of chondrocytes-seeded fibrin scaffold, is housed. The deformation of the membrane pushes the construct against a pillar positioned above it thus generating a compressive loading. The hydraulic pressure that pushes the membrane is generated inside an inflation chamber where, by using a peristaltic pump to create a flow of water and a solenoid valve downstream of the chamber, the value and frequency of stimulation can be controlled by varying the flow rate and the closing time of the valve. The developed bioreactor consists of 3 parts, starting from the bottom we find the inflation chamber consisting of two cylindrical chambers and a channel that crosses them to fill them with water.The second part, the central one, instead, has only two culture chambers that will accommodate the scaffold and the culture medium. Between the two parts will be inserted the elastic membrane that will separate the two compartments and that in the upper part will accommodate the scaffold. Lastly, the third part, the one that will close the culture chambers on the top, is a polycarbonate lid with, on the lower face, the two pillars on which the scaffold is pressed against. First, to design the device, computational models have been made with COMSOL Multiphysics® to simulate the behaviour of the bioreactor and to verify that the specifications required for proper construct stimulation were obtainable with the device. In particular, simulations have been carried out on them to assess the response of the bioreactor based on different conditions such as the membrane response as a function of the pressure applied by the water in the inflation chamber or the different scaffold responses based on their constituent material. In this way it has been verified as the desired stimulation to be applied to the construct, equal to a 10 and 30% strain of the scaffold was possible using this bioreactor. After simulating and verifying the proper functioning of the device, CAD (Computer Aided Design) models have been created for the three parts of the bioreactor and the moulds to be used for the realization of the elastic membrane. These models, were then used to create CAM (Computer Aided Manufacturing) models necessary for the realization of the parts with the CNC (Computer Numerical Control) method. Starting from the bioreactor technical drawings and CAD models the volume of water and the flow rate needed inside the inflation chamber to obtain a deformation of the scaffold ranging from 10% to 30% with a frequency of 1 Hz, known to be an ideal parameter for the mechanical stimulation of chondrocytes, was calculated.[6, 7] Based on this information, the hydraulic circuit was designed to generate an hydraulically-driven compressive stimulation within the inflation chamber. The circuit will consist of a peristaltic pump, the bioreactor, a solenoid valve and a reservoir. By setting the right flow rate and the frequency of opening and closing of the valve in a correct way, it will be possible to impose a chosen strain and rate of stimulation on the structure. A control system based on the Arduino microcontroller has been, then, designed and built to control these devices. Not only the pump and valve have been connected to it, but also support devices for the end user in order to make the control interface more intuitive. These devices are an LCD screen and a 4x4 keypad from where the user can select the desired flow rate or strain. It was also necessary to develop a code to control all the connected devices and to make them work as desired, in particular, thanks to the code, first you can see on the screen the instructions to be able to control the pump at its best, then, you can use the keypad to set the desired flow rate or strain values. Once the device was assembled at the laboratory of the UCL-GOS Institute of child health in London, with the collaboration of the Professor Ferretti’s research group, the proper functioning of the control circuit and the hydraulic one was tested. In the future, tests will be carried out to evaluate the correct deformation of the membrane to reach the desired strain, using, for example, optical measuring systems. The developed bioreactor designed, together with the control circuit, has a great potential for the stimulation not only of cartilage, but of all those tissues that need a compressive stimulus for proper development. The bioreactor is sterilizable in autoclave, in fact all the pieces are made with materials that can be sterilized with this technique; it is very versatile and could be used with all the 3D constructs that you would like to stimulate with this compressive stimulus; is compact and practical, as well as easy to use thanks to the user interface created with the LCD screen and keypad; the stimulation is easily controlled thanks to the control circuit created, and thanks to it is also automated. The control circuit is also easily reprogrammable, by varying the custom made code. Lastly, in future development by creating more culture chambers it will be possible to easily use more bioreactors and manage them simultaneously with a single control system. Also, the development of an automatic change of the medium, will be very useful to avoid user intervention on the culture chamber to reduce the risk of contamination.

La cartilagine è un tessuto connettivo di supporto che copre e protegge le estremità delle ossa lunghe in corrispondenza delle articolazioni e ha anche una funzione di supporto strutturale per il naso, le orecchie, i bronchi, i dischi intervertebrali e molte altre componenti del corpo. [1] L'aspetto della cartilagine che porta allo studio di nuove terapie innovative mediante tecniche di medicina rigenerativa è la scarsa capacità di rispondere ai danni subiti, infatti, nel caso di malattie infiammatorie degenerative o lesioni traumatiche, il tessuto non guarisce spontaneamente.[1] Questo tessuto è soggetto a malattie infiammatorie degenerative molto comuni come l'osteoartrite o l'artrite reumatica, nonché a lesioni traumatiche che possono progressivamente causare la degenerazione del tessuto a causa della mancanza di rinnovamento cellulare. In particolare, l'osteoartrite (OA) è una malattia cronica caratterizzata dal deterioramento della cartilagine nelle articolazioni, circa 300 milioni di persone in tutto il mondo soffrono di OA, ed è considerata la principale causa di disabilità negli adulti, perché provoca dolore molto forte, perdita della funzione articolare e diminuzione della qualità della vita per coloro che ne soffrono.[2, 3] Gli obiettivi principali delle terapie per la cura delle malattie legate alla cartilagine oggi includono minimizzare il dolore articolare e il gonfiore, prevenire le deformità (come la deviazione ulnare) e erosioni della cartilagine, mantenere alta la qualità della vita (personale e lavorativa), e il controllo sulle manifestazioni extra-articolari. Se i farmaci, come quelli antinfiammatori o l'antireumatici, non bastano, le principali strategie di riparazione della cartilagine comprendono il debridement, la stimolazione del midollo osseo, le tecniche a base cellulare e quelle con cellule e scaffold, e il trapianto dell’ intero tessuto [4]. Queste tecniche cercano di compensare la scarsa capacità rigenerativa della cartilagine favorendo la colonizzazione del sito danneggiato da parte di cellule in grado di rigenerare il tessuto. Le tecniche utilizzate oggigiorno però vanno incontro a gravi complicazioni, ad esempio il tessuto neoformato non ha caratteristiche meccaniche pari a quello nativo, alcune tecniche richiedono l’espianto di una parte di tessuto da una zona meno caricata per l’impianto nel sito danneggiato, causando morbilità nel sito donatore. Inoltre altri limiti sono ad esempio la quantità limitata degli impianti che possono essere prelevati o, se si utilizza una protesi in casi estremi per una totale sostituzione del tessuto, essa potrà causare una reazione da corpo esterno nel paziente o ci potrebbe essere bisogno di una nuova operazione chirurgica in caso di fallimento dell’impianto che risulterebbe molto più complessa e rischiosa rispetto alla prima operazione. Per sopperire a queste complicazioni sono state sviluppate tecniche innovative che sfruttano una strategia basata sull’ingegneria dei tessuti. L'ingegneria dei tessuti è definita come quel campo interdisciplinare che applica i principi e i metodi dell'ingegneria e delle scienze della vita al fine di sviluppare sostituti biologici per la manutenzione, la riparazione, la sostituzione o il miglioramento funzionale di tessuti biologici o interi organi. [5] Lo scopo di questo progetto di tesi è stato quello di progettare e costruire un bioreattore per la stimolazione meccanica dei condrociti, in grado di applicare una stimolazione compressiva generata da una pressione idraulica, sfruttando la deformazione di una membrana elastica in silicone dove vi è alloggiato uno scaffold in fibrina sul quale vengono seminati i condrociti. La deformazione della membrana spinge il costrutto contro un pillar posizionato sopra di esso generando così un carico compressivo. La pressione idraulica che spinge la membrana viene generata all'interno di una camera di gonfiaggio dove, utilizzando una pompa peristaltica per creare un flusso d'acqua e una elettrovalvola a solenoide a valle della camera, non solo è possibile creare questa pressione, ma è anche possibile controllare il valore e la frequenza di stimolazione variando la quantità di portata d'acqua e il tempo di chiusura della valvola. Il bioreattore è costituito da 3 parti, partendo dal basso troviamo la camera di gonfiaggio costituita da due camere cilindriche e da un canale che le attraversa per riempirle d'acqua.La seconda parte, quella centrale, invece, ha solo due camere di coltura che ospiteranno lo scaffold e il terreno di coltura. Tra le due parti verrà inserita la membrana elastica che separerà i due compartimenti e che nella parte superiore ospiterà il costrutto. Infine, la terza parte, è un coperchio in plexiglas con, sulla faccia inferiore, i due pillar sui vengono pressati gli scaffold. Per prima cosa, per progettare il dispositivo, sono stati realizzati dei modelli computazionali con COMSOL Multiphysics®, per simulare il comportamento del bioreattore e per verificare che le specifiche necessarie per una corretta stimolazione dei costrutti fossero ottenibili con il dispositivo. In particolare, sono state effettuate delle simulazioni per valutare la risposta del bioreattore in base a condizioni diverse, come la risposta della membrana in funzione della pressione applicata dall'acqua nella camera di gonfiaggio o le diverse risposte dello scaffold in base al suo materiale costitutivo. Dalle simulazioni effettuate si è verificato come la stimolazione desiderata da applicare al costrutto, pari ad una deformazione dello scaffold di 10 e 30% fosse ottenibile con questo bioreattore. Dopo aver simulato e verificato il corretto funzionamento del dispositivo, sono stati creati modelli CAD (Computer Aided Design) per le tre parti del bioreattore e gli stampi da utilizzare per la realizzazione della membrana elastica. Questi modelli, sono stati poi utilizzati per creare modelli CAM (Computer Aided Manufacturing) necessari per la realizzazione delle parti con il metodo CNC (Computer Numerical Control). Partendo dai disegni tecnici del bioreattore e dai modelli CAD è stato calcolato il volume d'acqua e la portata necessaria all'interno della camera di gonfiaggio per ottenere una deformazione dello scaffold del 10% e del 30% con una frequenza di 1 Hz, ideale per la stimolazione meccanica dei condrociti. [6, 7] Sulla base di queste informazioni, è stato progettato il circuito idraulico per generare una stimolazione compressiva idraulica all'interno della camera di gonfiaggio. Il circuito sarà costituito da una pompa peristaltica, dal bioreattore, da una valvola a solenoide e da un serbatoio. Impostando la giusta portata e la frequenza di apertura e chiusura della valvola in modo corretto, sarà possibile ottenere una deformazione e una velocità di stimolazione desiderata sulla struttura. Un sistema di controllo basato sul microcontrollore Arduino è stato quindi progettato e costruito per controllare questi dispositivi. Non solo la pompa e la valvola sono state collegate al circuito di controllo, ma anche dispositivi di supporto per l'utente finale al fine di rendere l'interfaccia di controllo più intuitiva. Questi dispositivi sono uno schermo LCD e un tastierino 4x4 da cui l'utente può selezionare la portata o la deformazione desiderata. È stato necessario, inoltre, sviluppare un codice per controllare tutti i dispositivi collegati e farli funzionare a piacimento, in particolare, grazie al codice, in primo luogo è possibile vedere sullo schermo le istruzioni per poter controllare al meglio la pompa, quindi, è possibile utilizzare la tastiera per impostare la portata o i valori di deformazione desiderati. Una volta assemblato il dispositivo presso il laboratorio dell' “UCL-GOS Institute of child health” di Londra, con la collaborazione del gruppo di ricerca della Prof.ssa Ferretti, è stato testato il corretto funzionamento del circuito di controllo e di quello idraulico. In futuro saranno effettuate anche delle prove per valutare la corretta deformazione della membrana, utilizzando, ad esempio, sistemi di misurazione ottici. Il bioreattore sviluppato, insieme al circuito di controllo, ha un grande potenziale per la stimolazione non solo della cartilagine, ma di tutti quei tessuti che necessitano di uno stimolo compressivo per una corretta crescita. Il bioreattore è sterilizzabile in autoclave, infatti tutti i pezzi sono realizzati con materiali che possono essere sterilizzati con questa tecnica; è molto versatile e può essere utilizzato con tutti i costrutti 3D che si desidera stimolare con questo stimolo compressivo; è compatto e pratico, oltre che facile da usare grazie all'interfaccia utente creata con lo schermo LCD e la tastiera; la stimolazione è facilmente controllabile grazie al circuito di controllo creato, e grazie ad esso è anche automatizzata. Il circuito di controllo è anche facilmente riprogrammabile, variando il codice creato ad hoc per questo bioreattore. Infine, in futuro, grazie alla creazione di più camere di coltura, sarà possibile utilizzare più bioreattori e gestirli contemporaneamente con un unico sistema di controllo. Inoltre, anche la futura realizzazione di un cambio automatico del terreno di coltura, sarà molto utile per evitare l'intervento dell'utente sulla camera di coltura per ridurre il rischio di contaminazione.