Microfluidic analysis of phase-separating polymers and their use in bioseparation

In the last years, the use of biologics as therapeutic agents has gained increasing interest in the pharmaceutical industry. In particular, monoclonal antibodies constitute the majority of the available products. The most up-to-date example of bioproducts are RNA-based vaccines, which are based on the direct administration of mRNA molecules encoding for virus proteins. At the same time, novel classes of promising biologics, such as extracellular vesicles are starting to emerge. Fundamental research on these new classes of biologics as well as their industrial production need the development of specific upstream and downstream processes. In particular, industrial downstream processes generally contribute to the half of the production costs. The isolation of biologics from the complex mixture they are produced in is critical as it must guarantee a high yield and exceptional selectivity to avoid contaminations. Standard technologies include centrifugation, filtration, and chromatography techniques. Nevertheless, these are often limited by low throughput performances. Open compartments biology constitutes a solid ground to develop bioinspired approaches that could face efficiency and throughput limitations of standard strategies. Intrinsically disordered proteins (IDPs) perform liquid-liquid phase separation (LLPS) which leads to the formation of a liquid protein-rich phase in a liquid milieu. This behaviour can be reproduced synthetically imitating low complexity domain (LCDs), those IDPs region that drive LLPS and define its characteristics. The possibility to trigger their phase separation renders this class of polymers an attractive candidate for the separation of complex biologics. To exploit these polymers, their behaviour must be deeply understood and highly predictable. Accordingly, it emerges the need of new analytical tools for their characterization. Droplet microfluidics is likely to represent a powerful technique in consideration of its numerous advantages namely high-throughput, compartmentalization, and fine temperature control. This thesis fits in a bigger framework of an on-going research activity in the group, which aims at designing and controlling phase separation of macromolecules for applications in biotechnology. Specifically, this thesis consisted of two aims. First, the development of novel strategies for the high-throughput characterization of smart polymers undergoing liquid-liquid phase separation. We performed the thermodynamic and kinetic characterization of two reference thermo-responsive polymers, highlighting advantages and limitations of each method and therefore defining their best application. Secondly, we demonstrated that smart polymers can be used in the separation of macromolecules, employing different strategies such as affinity precipitation and ion-exchange precipitation. We demonstrated the former with the recruitment of extracellular vesicles and we developed ion-exchange precipitation protocols to straightforwardly uptake and release standard proteins and liposomes. These results open attractive applications in preparative bioseparation and diagnostics.

Gli agenti terapeutici biologici stanno di anno in anno conquistando un ruolo sempre più importante nell’industria biofarmaceutica; in particolare, gli anticorpi monoclonali costituiscono la maggioranza dei prodotti approvati per il commercio. L'esempio più recente di biofarmaci sono i vaccini a RNA, i quali si basano sulla somministrazione diretta di molecole di mRNA codificanti per le proteine del virus. Allo stesso tempo a fianco dei più tradizionali prodotti terapeutici biologici stanno emergendo nuove promettenti alternative, che comprendono ad esempio le vescicole extracellulari. Sia la ricerca di base su queste nuove classi di biofarmaci che la loro produzione industriale richiede lo sviluppo di specifici processi di upstream e downstream; in particolare, questi ultimi contribuiscono generalmente alla metà dei costi di produzione. Nello specifico la separazione dei biofarmaci dalla soluzione complessa in cui sono prodotti è fondamentale in quanto deve garantire un'elevata resa e selettività per evitare ogni possibile contaminazione. Al giorno d’oggi le tecnologie standard comprendono la centrifugazione, la filtrazione e la cromatografia; tuttavia questi sono spesso limitati da prestazioni a basse performance. La biologia open compartments costituisce una base solida per sviluppare approcci bioispirati che consentano di superare le limitazioni di efficienza e rendimento delle tecniche standard. Le proteine intrinsecamente disordinate (IDP) vanno incontro a separazione di fase liquido-liquido (LLPS), la quale porta alla formazione di una fase liquida ad alta concentrazione di proteine in un ambiente anch’esso liquido. Questo comportamento può essere riprodotto sinteticamente imitandone i domini a bassa complessità (LCD), ossia quelle regione delle proteine intrinsecamente disordinate che guidano la transizione di fase e ne definiscono le caratteristiche. La possibilità di innescare e controllare la loro separazione di fase rende questa classe di polimeri un candidato ideale per la separazione di biologici complessi. Per poter sfruttare questi polimeri è necessario che il loro comportamento sia compreso a fondo ed altamente prevedibile: emerge dunque la necessità di sviluppare nuovi strumenti analitici per la loro caratterizzazione. La microfluidica droplet-based costituisce una tecnica ad alto potenziale, considerando i suoi numerosi vantaggi come l’alto rendimento, la possibilità di creare compartimenti separati e di controllare finemente la temperatura. Questo progetto di tesi si inserisce in un più ampio contesto all’interno dell’attività di ricerca sviluppata nel gruppo il cui scopo è investigare come l’architettura della catena polimerica e le condizioni esterne impattino sul comportamento del materiale. Nello specifico questa tesi si pone due scopi. In primo luogo lo sviluppo di strategie innovative ed agevoli per la caratterizzazione ad alto rendimento di polimeri cha vanno incontro a separazione di fase. Abbiamo completato la caratterizzazione termodinamica e cinetica di due polimeri responsivi alla temperatura evidenziando i vantaggi e le limitazioni di tre metodi utilizzati e definendone dunque il loro migliore utilizzo. In secondo luogo abbiamo dimostrato come i polimeri intelligenti possano essere sfruttati in un contesto biotecnologico per la separazione di macromolecole, utilizzando due strategie distinte: la precipitazione per affinità e la precipitazione per scambio ionico. In particolare, abbiamo provato la possibilità di reclutare vescicole extracellulari con il primo metodo e ci siamo poi concentrati sullo sviluppo di un protocollo funzionale alla cattura e al rilascio di proteine standard e liposomi. Questi risultati aprono la strada ad applicazioni dei polimeri intelligenti sia nella bioseparazione preparativa che nella diagnostica.