Development of a cell placement system for building in vitro neural networks

Neural networks in vitro with a controlled topology have shown to be a useful and reproducible tool for i) studying how network functionality arises from the underlying structural motif, ii) studying the development of neurodegenerative processes and iii) screening new treatments. The topological constraints are given by elestomeric microstructure, made by polydimethylsiloxane (PDMS), with wells for initial cells placement and microchannels for axonal growth. The common technique to place cells inside the wells is to seed cells suspension over the microstructures and let the cells sediment at bottom of the well. This does not allow to have a tight control on the number and on the type of cells per well. Being able to deposit a controlled number of cells in each well will increase the reproducibility, reducing the variation in the structure and in the functionality that can arise between samples. The control on the type of cells deposited will enable the study of the interaction and functionality of different cells present in the brain. Adding astrocytes has been shown to support the survival of neurons seeded at low density. The available technologies for cells placement do not provide the requirements to deposit a defined number and type of cells with a high throughput and in a automatic way. In this perspective, a cells placement system for building in vitro neural network with a controlled topology was assembled and tested with micrometric polystyrene particles and validated with primary neurons from rat cortex. In particular, the system used glass pipettes with microscale openings as printing nozzles, which could be positioned with micrometric precision control stages and interfaced with a fluidic system to maintain accurate fluid flow and electrical readout for cell deposition and counting. The cells passing through the pipette opening were counted exploiting the “Coulter counter” principle. The system was able to detect the polystyrene particles and neurons, count them and stop the flow as soon as the target number of particles was deposited. The system was automated to load the particles into the pipette from one bath and to deposit them in another bath. Three deposition strategies within microfluidic wells were developed and tested. None of them produced a controlled deposition within them.

Reti neurali in vitro a topologia controllata si sono dimostrate uno strumento utile e riproducibile per i) studiare come la funzionalità della rete derivi dal motivo strutturale sottostante, ii) studiare lo sviluppo di processi neurodegenerativi e iii) vagliare nuovi trattamenti. I vincoli topologici sono dati dalla microstruttura elestomerica, costituita da polidimetilsilossano (PDMS), con pozzetti per il posizionamento iniziale delle cellule e microcanali per la crescita degli assoni. La tecnica comune per posizionare le cellule all'interno dei pozzetti consiste nel seminare la sospensione delle cellule sulle microstrutture e lasciare che le cellule sedimentino sul fondo del pozzetto. Ciò non consente di avere uno stretto controllo sul numero e sul tipo di celle per pozzetto. Poter depositare un numero controllato di cellule in ogni pozzetto aumenterà la riproducibilità, riducendo la variazione nella struttura e nella funzionalità che possono sorgere tra campioni. Il controllo sul tipo di cellule depositate consentirà lo studio dell'interazione e della funzionalità di diverse cellule presenti nel cervello. Infatti, è stato dimostrato che l'aggiunta di astrociti supporta la sopravvivenza dei neuroni seminati a bassa densità. Le tecnologie disponibili per il posizionamento delle celle non forniscono i requisiti per depositare un numero e un tipo definito di cellule con una throughput elevato e in modo automatico. In questa prospettiva, un sistema di posizionamento delle cellule per costruire una rete neurale in vitro con una topologia controllata è stato assemblato e testato con particelle micrometriche di polistirene e validato con neuroni primari della corteccia di ratto. In particolare, il sistema ha utilizzato pipette di vetro con aperture su microscala come ugelli di stampa, che potevano essere posizionati con stadi di controllo di precisione micrometrica e interfacciati con un sistema fluidico per mantenere un flusso di fluido accurato e lettura elettrica per deposizione e conteggio delle cellule. Le cellule passanti attraverso l'apertura della pipetta sono state conteggiate sfruttando il principio del “contatore Coulter”. Il sistema è stato in grado di rilevare le particelle di polistirene e i neuroni, di contarle e di fermare il flusso non appena il numero target di particelle era stato depositato. Il sistema è stato automatizzato per caricare le particelle all’interno della pipetta da un bagno e per depositarle in un altro bagno. Sono state sviluppate e testate tre strategie di deposizione all'interno dei pozzetti microfluidici. Nessuna di loro ha prodotto una deposizione controllata al loro interno.