Multispectral fluorescence lifetime imaging microscopy based on single-pixel camera detection

Multispectral Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy is a novel and promising tool to study various biological processes. This technique exploits fluorescence lifetime as imaging contrast parameter to build a pixel-by-pixel image of the sample under consideration. The fluorescence lifetime map helps one to discriminate amongst different fluorophores and to get information such as local pH, oxygen concentration in cells, and other parameters of fundamental importance in biology and medicine applications. Standard FLIM setups generally combine confocal or multiphoton microscopy, providing axial and optical sectioning, with a Time Correlated Single Photon Counting (TCSPC) board for lifetime measurements. In this thesis a novel approach to fast multispectral FLIM is presented, involving structured illumination patterns and a Single Pixel Camera (SPC) detection. The introduction of an SPC device allows not only the use of new techniques of signal processing, like compressed sensing, but also novel way of data analysis faster than the standard ones. Dataset considered for the analysis in this work are of two types: simulated dataset obtained by a simulator developed in MatLab in this thesis work, and experimental dataset, acquired through the laboratory set-up. In particular, the Simulator has allowed to test different methods of analysis in different conditions, and more specifically, in this work data have been analysed with two different algorithms, the Standard Method and the Fast Fit Method. In Standard Method a non-linear fit over the temporal decay curve contained in each point of the image is performed, and so scrolling the image pixel-by-pixel allows to obtain lifetimes and exponential amplitudes of these curves. Once reordered such values, it is possible the reconstruction and visualization of the sample as a function of these parameters. This methodology is accurate in retrieving lifetimes values, and the results are useful especially when two or more fluorophores are characterized by similar fluorescence lifetimes, but it requires the completion of measurement acquisition and the subsequent spatial inversion of the dataset. This means that the computational time for this analysis can be quite long. On the contrary, the proposed Fast Fit Method opens the road to a new and quicker way to analyse fluorescence lifetime imaging data. Indeed, the algorithm works over the matrix of measurements not yet spatially inverted, and after estimation of lifetimes through a single non-linear fit over the widefield pattern, it solves a linear problem to find the associated amplitudes maps. So, since it is not taken a non-linear fit for each pixel of the image but just one at the beginning of the procedure, the computational time in this case is lower than the one in Standard Method. The estimation of lifetimes in this case is actually more complicated , involving more exponentials in the fit, and less precise than in the previous approach. It is worth noting that this method has been developed not to provide a more accurate estimation of the fluorescence lifetimes, but to provide a faster representation of the amplitudes maps. Besides, since this analysis can be performed in parallel with the measurements acquisition process, it can be useful in real time applications, very frequent for example in cell biology or biomedicine. In the course of this thesis, all the results of the analysed datasets will be presented, evidencing pros and cons of both methods in different situations, and setting new goals for future studies, particularly about the improvements in multi-exponential non-linear fit, and its stability with respect to noise contribution.

La tecnica di FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) multispettrale è un nuovo e promettente strumento per lo studio di diversi processi biologici. Essa sfrutta il tempo di vita della fluorescenza come elemento di contrasto per costruire, pixel per pixel, un’immagine del campione sotto osservazione. La mappa del tempo di vita può aiutare nella distinzione tra diversi fluorofori e ad ottenere informazioni come il pH locale, la concentrazione di ossigeno nelle cellule e altri parametri di fondamentale importanza in applicazioni biologiche e mediche. I sistemi generalmente utilizzati per la FLIM combinano la microscopia confocale o multifotoni, che forniscono sectioning assiale e ottico, con una scheda Time Correlated Single Photon Counting (TCSPC) per le misure del tempo di vita. In questa tesi è presentato un nuovo approccio alla FLIM, che coinvolge pattern di luce strutturata e una Single-Pixel Camera (SPC). L’introduzione della SPC non ha solo permesso di utilizzare nuove tecniche di elaborazione del segnale, come il compressed sensing, ma anche di sviluppare nuovi metodi di analisi dei dati più veloci di quelli standard. I dataset considerati nelle analisi di questa tesi sono di duplice natura: una simulata, creata tramite un software MatLab, e l’altra di tipo sperimentale, ottenuta tramite acquisizione da set-up di laboratorio. In particolare, il Simulatore ha permesso di testare i diversi metodi di analisi in varie condizioni e più precisamente, in questo lavoro i dati sono stati processati tramite due diversi algoritmi, il Metodo Standard e il Metodo Fast Fit. Nel Metodo Standard viene fatto un fit non lineare sulla curva di decadimento temporale contenuta in ciascun pixel dell’immagine, e quindi scorrendo l’immagine pixel per pixel si possono ottenere i tempi di vita e le ampiezze degli esponenziali di queste curve. Una volta riordinati tali valori, sarà possibile la ricostruzione e visualizzazione dell’immagine del campione in funzione di questi parametri. Questo algoritmo è accurato nello stimare i valori dei tempi di vita, e risulta utile specialmente quando due o più fluorofori sono caratterizzati da un tempo di vita simile, ma richiede il completamento dell’acquisizione delle misure e la conseguente inversione spaziale del dataset. Questo significa che il tempo di elaborazione per questa analisi può essere abbastanza lungo. Al contrario, il Metodo Fast Fit apre la via ad un nuovo e più rapido modo di analizzare i dati relativi alla fluorescenza e ai tempi di vita. Infatti, questo algoritmo lavora sulla matrice delle misure non ancora spazialmente invertita, e dopo aver stimato i tempi di vita tramite un singolo fit non lineare sul pattern widefield, risolve un problema lineare per trovare le mappe delle ampiezze associate. Di conseguenza, non essendo fatto un fit non lineare per ognuno dei pixel dell’immagine, ma solo uno ad inizio procedura, il tempo di elaborazione in questo caso sarà inferiore al precedente. La stima dei tempi di vita in questo caso è più complicata, data la presenza di più esponenziali, e risulta meno precisa che nel precedente approccio: a tal proposito, si noti che questo metodo è stato sviluppato non tanto per un esatto calcolo dei tempi di vita, quanto più per una rapida rappresentazione della mappa delle ampiezze. Oltretutto, dato che questa analisi può essere portata in parallelo con il processo di acquisizione delle misure, può essere molto utile in applicazioni in tempo reale, molto frequenti in biologia cellulare o biomedicina. Nel corso della tesi, sono presentati tutti i risultati relativi all’analisi dei dataset, evidenziandone pro e contro in diverse situazioni e definendo obiettivi per studi futuri, volti a migliorare i fit non lineari di carattere multi-esponenziale e la sua stabilità rispetto al contributo del rumore.