Sviluppo e caratterizzazione di rivestimenti sol-gel in biossido di titanio per impianti ortopedici

Periprosthetic infections represent one of the most serious and frequent complications related to prosthetic devices (1.5-2% for hip replacements, 2-5% for knee replacements, with increasing percentages in revision surgery). Over the past decade, the incidence of periprosthetic infections has dramatically increased owing to bacteria resistant to numerous antimicrobial agents. A key moment during the pathogenesis of periprosthetic infection is the ability of microbial populations to produce "biofilm", which is a stable community of bacteria incorporated inside a stabilizing polymeric matrix ("Slime" or Extracellular Polymer Substance: EPS). It has been hypothesized that this matrix does not allow the diffusion of antibiotics in bacterial cells and gives a significant degree of protection against antibodies and macrophages resulting in a difficult eradication of the infection. Nowadays, a strategy capable of totally eliminating the incidence of infections does not exists. The first phase of an infection consists of the initial adhesion of microbes to the implantation site, which marks the beginning of the failure process for the latter. To prevent this, is necessary to make the surface of the implant non-adhesive or bactericidal, especially considering that it is between the biomaterial and tissue where the infection can expand and become of clinical relevance. For this reason, the scientific research is focused on preventing bacterial adhesion and inhibiting proliferation on the surfaces of implantable devices. This involves the development of innovative materials, with composition and properties capable not only reducing the formation of biofilm, but also improving osseointegration. In our study we have chosen to exploit a titanium dioxide (TiO2) coating in which we have incorporated antibacterial ions, such as copper and zinc, in order to minimize adhesion and bacterial colonization of the substrate. The chemical technique used during the sol-gel strategy, which involves the hydrolysis of the starting alkoxide in aqueous solvent (titanium tetraisopropoxide in our case), the formation of a colloidal suspension and finally the evolution of the latter towards a gel, through a condensation process. The first step was the synthesis of the titanium dioxide sol with the consequent adding of salts of copper (copper acetate monohydrate) and zinc (zinc acetate dihydrate). Then the deposition of coating was performed by dip-coating technique, which consists of immersing the substrates (small discs made of cobalt-chromium alloy, ISO 5832-12) inside the colloidal solution and extracting it at speed constant, using a mini-dipper set up. Finally, we have used a heat treatment to evaporate the remaining solvent and stabilize the coating. The treated samples were then characterized by chemical (ICP and GD-OES), physical (XRD and contact angle measurements) and morphological (SEM-EDS) techniques. Furthermore, preliminary antibacterial test were carried out to investigate the antibacterial effect of copper and zinc. XRD analyzes showed the presence of crystallographic structure of anatase, useful for its antibacterial and bioactivity properties. Thanks to the ICP and GD-OES analyzes, we were able to quantify the concentrations of ions actually present in the coating compared to those added in solution and estimate the its thickness. Contact angle measurements were performed to understand the wettability features of the surface of the samples. In addition, SEM-EDS analyses were used to characterize the morphology of substrates before and after the application of the coating. Finally, antibacterial microbiological tests were carried out, evaluating the 24-hour proliferation of Staphylococcus aureus in order to evaluate the effective antibacterial activity of coating. The antibacterial tests showed a moderate bactericidal effect, especially for the samples treated with a salt concentration equal to 0.05 M. The use of this approach should be useful in preventing infections of orthopedic implants in the future. Future studies will include a deeply investigation of the stability and roughness of the coating, ion release tests, new antibacterial tests on different bacterial strains and cytocompatibility and cytotoxicity assays.

Le infezioni periprotesiche rappresentano una delle complicazioni più gravi e frequenti che possono coinvolgere i dispositivi protesici (1,5-2 % per le protesi d’anca, 2-5 % per quelle di ginocchio, con percentuali che aumentano nella chirurgia di revisione) [1]. Negli ultimi dieci anni è drammaticamente aumentata l’incidenza di infezioni periprotesiche causate da batteri resistenti a numerosi agenti antimicrobici. Momento fondamentale nella patogenesi dell’infezione periprotesica è la capacità delle popolazioni microbiche di produrre il “biofilm”, comunità stabile di batteri incorporata in una matrice polimerica stabilizzante (“Slime” o Sostanza Polimerica Extracellulare: EPS). Si è ipotizzato che tale matrice non permetta la diffusione degli antibiotici nelle cellule batteriche [2] e conferisca un notevole grado di protezione nei confronti di anticorpi e macrofagi con conseguente difficile eradicazione dell’infezione [3]. Al momento, non esiste una strategia unica in grado di eliminare totalmente l'incidenza delle infezioni associate ai biomateriali. La prima fase di un'infezione è costituita dall'adesione iniziale di microbi nel sito di impianto, che segna l’inizio del processo di fallimento di quest’ultimo. Per evitare che ciò accada, bisogna rendere la superficie dell'impianto non adesiva o battericida, considerato che è tra biomateriale e tessuto che l’infezione può espandersi e diventare di rilevanza clinica. Per tale ragione, la ricerca scientifica sui biomateriali ultimamente è focalizzata sulla prevenzione dell'adesione batterica e sull'inibizione della proliferazione sulle superfici dei dispositivi impiantabili. Ciò comporta lo sviluppo di materiali innovativi, con composizione e proprietà in grado di migliorare l’osteointegrazione e ridurre la formazione del biofilm. Nel nostro studio abbiamo scelto come strategia, la realizzazione di un coating di biossido di titanio (TiO2) nel quale incorporare ioni antibatterici, in questo caso rame (Cu2+) e zinco (Zn2+). Questi sono stati aggiunti sotto forma di sali, con l’obiettivo di minimizzare l’adesione e la colonizzazione batterica del substrato. La tecnica chimica utilizzata è quella sol-gel, che implica l'idrolisi in solvente acquoso dell'alcossido di partenza (titanio tetraisopropossido nel nostro caso), la formazione di una sospensione colloidale e l'evoluzione di quest'ultima verso un gel, attraverso un processo di condensazione. Il primo step è stato quindi la preparazione del sol di biossido di titanio con conseguente aggiunta dei sali antibatterici (acetato di rame monoidrato e acetato di zinco diidrato). A ciò, è seguita la deposizione del sol tramite tecnica dip-coating, che consiste nell’immergere il substrato del campione da rivestire (dischetti in lega di cobalto-cromo, ISO 5832-12) all’interno della soluzione colloidale ed estrarlo a velocità costante, utilizzando un mini-dipper. Infine, abbiamo utilizzato un trattamento termico in stufa in modo da far evaporare il solvente restante e stabilizzare il rivestimento. I campioni trattati sono stati sottoposti poi a caratterizzazioni chimiche (ICP e GD-OES), fisiche (XRD e misure di angolo di contatto), morfologiche (SEM-EDS) e ad analisi microbiologiche per dimostrare l’effetto antibatterico di rame e zinco. Le analisi XRD hanno mostrato come il rivestimento in biossido di titanio sia caratterizzato unicamente dalla struttura cristallografica dell’anatasio, utile per le sue proprietà antibatteriche e di bioattività; grazie alle analisi ICP e GD-OES, siamo riusciti a quantificare le concentrazioni degli ioni antibatterici effettivamente presenti nel coating rispetto a quelle aggiunte in soluzione e stimare lo spessore di quest’ultimo; misure di angolo di contatto sono servite per definire la bagnabilità della superficie dei campioni e misure al SEM-EDS per caratterizzarne la morfologia prima e dopo l’applicazione del rivestimento. Infine sono state effettuate prove microbiologiche antibatteriche, andando a valutare la proliferazione a 24 ore di Staphylococcus aureus, per comparare il comportamento di campioni trattati e non trattati, in modo da valutare l’effettiva attività antibatterica di rame e zinco. I test antibatterici hanno mostrato un discreto effetto battericida da parte degli ioni, specie per i campioni trattati con concentrazione dei sali pari a 0,05 M. L’utilizzo della tecnica sol-gel può quindi in prospettiva rivelarsi utile nel prevenire le infezioni di impianti ortopedici. Studi futuri comprenderanno uno studio più approfondito della stabilità del coating, test di rilascio ionico, nuove prove antibatteriche su ceppi batterici diversi dal S.aureus, analisi rugosità sulla superficie dei campioni e prove di citocompatibilità e citotossicità.