Effetto delle nanoplastiche sull'aggregazione di B-amiloidi : studi preliminari in silico ed in vitro

Microplastics (MP) and nanoplastics (NP) are terms that now we can find in any media, which indicate small particles coming from daily plastic object such as, bottles and cloths made with synthetic fabrics (e.g. pile), that due to degradation, release into the environment fragments of different sizes. In particular, microplastic indicate bits between 0.1 and 5000mm, and nanoplastics when the fragments fall within the range of 1 to 100 nm. Once dispersed in the environment, plastic particles are ingested by animals and absorbed by plants entering the food chain. It is therefore important to investigate the mechanisms of interaction between micro and nanoplastics within biological organisms. Many studies in the literature have analyzed the interactions between micro and nanoparticles of plastic and macromolecules such as lipids and proteins. As regards the first, in several cases it has been observed how they can interact with plasma membranes varying the permeability and therefore selectivity. In the case of plastic-protein interactions, the various studies analyzed the formation of protein corona, observing how proteins had a greater predisposition for aggregation when the plastic particles were present. Silico analyses were carried out in systems consisting 5 nm nanoplastic particles in the presence of amyloidogenic peptides. Polyethylene (PE), polystyrene (PS), polyethylene terephthalate (PET) and polypropylene (PP) were the types of nanoplastics considered. For amyloidogenic proteins, the single peptide Aβ1-42 was studied, both in its full length and as fragments of different dimensions (Aβ16-20, and Aβ25-42). In addition to individual peptides, pre-aggregate forms have been studied in oligomers composed of 5 peptides. Finally, the different forms of the peptide Aβ1-42 were analyzed in the wild type phenotype and in the mutated form A2V. Molecular and macromolecular interactions and biophysical processes are studied with different techniques according to the desired detail’s level. All simulations presented in this study were performed with the molecular modeling software NAMD and displayed with VMD. The plastics were created through repetitions of the same monomer, made with the editor Avogadro, and through simulations in vacuum were compressed to obtain the desired a sphere of 5 nm in diameter. Protein Data Bank (PDB) was used for the search for beta amyloid proteins whose structures are known in the literature, from which it was possible to download the relevant file in .pdb format, while oligomers were built with Pymol software. For the different nanoparticles, it was chosen to start from a different number of chains depending on the plastic selected, but always getting a system composed of about 7000 atoms. In particular, the polyethylene (PE) was made from 16 C72H146 chains, for the polypropylene (PP) 36 C88H178 chains, for the polystyrene (PS) 16 C216H165 chains, and for the polypropylene terephthalate (PET) 25 C10H8O4 chains. The duration of the simulations is variable, with a length ranging from a few ns for the shorter simulations to hundreds of ns for the longer ones. Each nanoplastic has been made to interact with all the different proteins, and to get a better reliability, each system has been replicated 5 times. In order to observe possible difference in protein behavior, tests were carried out both in presence and absence of nanoplastics, and in a solvated and ionized environment. For the in vitro characterization, carried out in parallel with the in silico one, Aβ 25-42 peptides have been realized through the standard protocol of peptide synthesis. Subsequently, analyses were carried out with circular dichroism, spectrophotometer and AFM to study the evolution of the secondary structure of the protein in the presence of nanoparticles of PS with different size and charge. In this work, interesting results have been obtained on the interaction of β amyloid proteins with different types of nanoplastics. From the in silico analysis it has been possible to establish that, between polystyrene, polyethylene terephthalate, polypropylene and polyethylene, the last nanoplastic is the one that establishing the highest number of contacts/ns, determining the greatest interaction with the protein components. Polystyrene has a similar behavior, even though it has slightly lower number of contacts and RMSD values. For polyethylene terephthalate and polypropylene, both had an even lower number of contacts, ensuring greater stability in proteins during the analysis. In addition, the secondary structure of all the proteins in the oligomeric version, remained constant throughout the simulation and it has been possible to identify three contact zones, consisting of about 4/5 amino acids each. By identifying the amino acids of adhesion between nanoplastic and protein it has been possible to define the bond established between these as hydrophobic interactions. As regards in vitro analyses, it has been observed that polystyrene interacts differently with the peptide A25-42 as a function of charge and size. In fact, it has been seen that at smaller sizes, nanoplastics have given lower values in fluorescence, when compared with those obtained with the same in the larger version. In addition, neutral nanoplastics have given higher signals than charged nanoplastics with same size. Finally, positively charged nanoparticles generate more intense values than negative ones of equal size. A final important result was obtained thanks to the use of the Atomic Force Microscopy. In fact, there was a difference between the samples that had nanoplastic in solution and those where there were not. It was noted that nanoparticles, as the hours passed, were able in all cases to remove from the surface of the substrate, the layer of fibers that at zero time was present. This gave rise to two hypotheses about the fact that nanoplastics could be able to adsorb fibrils in their surface by removing them from the solution or were able to flake them back then to the previous stage: the toxic oligomeric one. In conclusion, it can be said that the nanoplastics present in the ecosystem are able, entering within living organisms, to interact and modify the cellular environment. As has been observed in this thesis work that all the nanoplastics analyzed, even if in a different way, are able to influence the proteins, thus altering their function. As nanoplastics are non-selective, it is still difficult to predict and understand what is the worst damage they can cause. Our study focused on the main protein responsible for Alzheimer and found that it is susceptible to nanoparticles Currently we are carrying out simulations that have the aim to understand if the nanoplastics can influence the amyloid fibrils already formed, and in the case, to bring them back to the oligomeric stage. Further studies may first focus on the interactions between nanoplastics and neurons, then move on to animal models, and finally verify how nanoplastics can be related to amyloid diseases, such as Alzheimer’s and tauopathies.

Microplastiche (MP) e nanoplastiche (NP), termini ormai comuni nei mezzi di comunicazione, indicano particelle derivanti da oggetti di uso quotidiano prodotti con materiali plastici, come bottiglie e capi d'abbigliamento sintetici (es. pile), i quali, degradandosi, rilasciano nell'ambiente frammenti di diverse dimensioni. Precisamente, si fa riferimento alle microplastiche per indicare i frammenti di dimensione compresa tra 0,1 e 5000 mm e alle nanoplastiche quando i frammenti rientrano nel range da 1 a 100 nm. Una volta disperse nell’ambiente, le particelle plastiche vengono ingerite dagli animali e assorbite dai vegetali entrando nella catena alimentare. Risulta importante quindi, indagare quali possano essere i meccanismi di interazione tra micro e nanoplastiche all’interno degli organismi biologici. Molti studi in letteratura hanno analizzato le interazioni tra micro e nanoparticelle di plastica e le macromolecole quali lipidi e proteine. Per quanto riguarda le prime, in vari casi si è osservato come possano interagire con le membrane plasmatiche variandone la permeabilità e quindi selettività. Nel caso invece delle interazioni plastica-proteine, i vari studi hanno analizzato la formazione delle corone proteiche, osservando come le proteine avessero una predisposizione maggiore per l’aggregazione in presenza della plastica stessa. Il presente lavoro di tesi ha come obiettivo lo studio, sia con approccio computazionale che sperimentale in vitro, delle interazioni che si instaurano tra diverse nanoparticelle di plastica e le proteine responsabili dell’Alzheimer. L’analisi è finalizzata alla comprensione del ruolo delle nanoplastiche nei processi di aggregazione dei peptidi amiloidi. Quest’ultimo rappresenta lo step iniziale nella formazione degli oligomeri, fisiologicamente tossici, che successivamente costituiscono le fibrille amiloidi. Le analisi in silico sono state effettuate su sistemi costituiti da una particella di nanoplastica delle dimensioni di circa 5 nm in presenza di peptidi amiloidogenici. Per quanto riguarda i tipi di nanoplastiche si è considerato il polietilene (PE), il polistirene (PS), il polietilene tereftalato (PET) ed il polipropilene (PP). Per quanto riguarda le proteine amiloidogeniche si è considerato il singolo peptide Aβ1-42, sia nella sua interezza, sia come frammenti di diversa lunghezza (Aβ16-20, e Aβ25-42). In aggiunta ai singoli peptidi, sono state studiate forme pre-aggregate in oligomeri composti da 5 peptidi. Infine, le diverse forme del peptide Aβ1-42 state analizzate nel fenotipo wild type e nella forma mutata A2V. Le interazioni molecolari e macromolecolari ed i processi biofisici sono studiati con diverse tecniche in funzione del livello di dettaglio desiderato. Tutte le simulazioni presentate in questo studio sono state eseguite con il software di modellazione molecolare NAMD e visualizzate con VMD. Le plastiche sono state create attraverso repliche dello stesso monomero, realizzato con l’editor Avogadro, e tramite simulazioni in vuoto sono state compresse sino ad ottenere una sfera da 5 nm di diametro. Per le proteine con strutture già note in letteratura, si è utilizzato il Protein Data Bank (PDB), dal quale si è potuto scaricare il relativo file in formato .pdb, mentre gli oligomeri sono stati costruiti con il software Pymol. Per le diverse nanoparticelle, si è scelto di partire da numero diverso di catene a seconda della plastica scelta per ottenere polimeri di circa 7000 atomi. In particolare, il polietilene (PE) è stato realizzato a partire da 16 catene C72H146, per il polipropilene (PP) 36 catene C88H178, per il polistirene (PS) 16 catene C216H165, e per il polietilene tereftalato (PET) 25 catene C10H8O4. Le simulazioni sono state fatte in condizioni al contorno periodiche e mantenendo costanti temperatura e pressione, precisamente ad una temperatura di 300 K e una pressione di 1 bar. Una volta prodotta la nanoplastica si verificata la sua stabilità in vuoto con una simulazione da 100 ps. Da questa è stato selezionato l’ultimo frame e usato come punto di partenza di ogni altra simulazione. I peptidi Aβ1-42, Aβ16-20, Aβ25-42 e la versione modificata A2V, sono stati implementati con Pymol. Infine, la fibrilla 5OQV è stata selezionata e scaricata dal PDB, dopo aver fatto una ricerca che prendeva in considerazione tutte le fibrille amiloidi presenti in letteratura. È stata selezionata la 5OQV in virtù del fatto che presenta una struttura maggiormente caratterizzata. Anche della fibrilla è stata studiata la versione che presentava la modifica A2V. La durata delle simulazioni è variabile, con un tempo che va da pochi ns per le simulazioni più brevi a centinaia di ns per quelle più lunghe. Ogni nanoplastica è stata fatta interagire con tutte le diverse proteine e, per avere una migliore attendibilità, ogni sistema è stato ripetuto 5 volte. Per poter osservare un’eventuale differenza nel comportamento della proteina, sono state effettuate prove della sola proteina e della proteina in presenza della nanoplastica, in entrambi i casi in ambiente solvatato e ionizzato. Per la caratterizzazione in vitro, svolta in parallelo a quella in silico, sono stati realizzati i peptidi A25-42 tramite il protocollo di sintesi peptidica standard. Successivamente sono state svolte analisi con il dicroismo circolare, con lo spettrofotometro e con l’AFM per studiare l’evoluzione della struttura secondaria della proteina in presenza di nanoparticelle di PS con dimensioni e carica diversa. Nel presente lavoro di ricerca, sono stati ottenuti interessanti risultati sull’interazione delle proteine β amiloidi con diversi tipi di nanoplastiche. Dall’analisi in silico è stato possibile stabilire che tra polistirene, polietilene tereftalato, polipropilene e polietilene, quest’ultima sia la nanoplastica che, instaurando il più alto numero di contatti/ns, determina una maggiore interazione con le componenti proteiche. Per il polistirene il discorso è analogo seppur presentando valori di Root-Mean-Square Deviation (RMSD) e numero di contatti leggermente inferiori. Per il polietilene tereftalato e il polipropilene si può affermare che entrambe hanno avuto un numero ancora inferiore di contatti, garantendo una maggiore stabilità nelle proteine durante l’analisi. Inoltre, la struttura secondaria di tutte le proteine in versione oligomerica si è mantenuta costante per tutta la durata della simulazione ed è stato possibile identificare tre zone di contatto, costituite circa da 4/5 aminoacidi ciascuna. Individuando gli amminoacidi di adesione tra nanoplastica e proteina è stato possibile definire il legame instaurato tra queste come interazione idrofobica. Per quanto concerne le analisi in vitro, si può affermare che il polistirene interagisce in maniera diversa con il peptide A25-42 in funzione di carica e dimensione. Si è visto infatti che a dimensioni inferiori, le nanoplastiche hanno dato dei valori più bassi in fluorescenza, indicando così una minore componente di aggregati proteici in forma amiloidogenica, se paragonati con quelli ottenuti con stesse in versione più grande. Inoltre, a parità di dimensione, le nanoplastiche neutre hanno dato dei segnali maggiori rispetto a quelle cariche. Infine, le nanoparticelle cariche positivamente generano dei valori più intensi rispetto a quelle negative di uguale grandezza. Un ultimo risultato di rilievo è stato ottenuto grazie all’utilizzo della microscopia a forza atomica. Infatti, si è riscontrata una differenza tra i campioni che avevano in soluzione nanoplastiche e quelli dove invece non erano presenti. In particolare, si è notato come le nanoparticelle con il passare delle ore, fossero in grado in tutti i casi di rimuovere dalla superficie del substrato, il tappeto di fibre che al tempo zero era presente. Questo ha fatto sorgere due ipotesi relative al fatto che le nanoplastiche potessero essere in grado di adsorbire nella loro superficie le fibrille rimuovendole dalla soluzione, oppure, fossero capaci di sfaldarle riportandole quindi allo stadio precedente: quello oligomerico tossico. In conclusione, si può affermare che le nanoplastiche presenti nell’ecosistema sono in grado, entrando all’interno degli organismi viventi, di interagire e modificare l’ambiente cellulare. Come si è osservato in questo lavoro di tesi, tutte le nanoplastiche, anche se in maniera differente, sono in grado di influenzare le proteine studiate alterandone quindi la conformazione tridimensionale. Essendo le nanoplastiche non selettive, è ancora difficile prevedere e comprendere quali possano essere i peggiori danni che sono in grado di provocare. Il nostro studio si è concentrato sulla proteina principale responsabile dell’Alzheimer riscontrando che sicuramente è influenzabile dalle nanoparticelle. Attualmente stiamo portando avanti delle simulazioni che hanno l’obbiettivo di comprendere se le nanoplastiche sono in grado di influenzare le fibrille amiloidi già formate, e nel caso, di sfaldarle riportandole allo stadio oligomerico. Studi futuri possono focalizzarsi sulle interazioni prima tra nanoplastiche e neuroni, per poi passare a modelli animali della malattia di Alzheimer, e verificare come queste possano effettivamente essere correlate a malattie amiloidi, quali Alzheimer.