Generation of in vitro microvascular networks with human dermal microvascular endothelial cells

The damage on microvasculature induced by radiotherapy is reported to be a current issue in cancer patients undergoing radiation therapy. The main alterations related to the treatment are apoptosis and death of the endothelial cells, senescence and alterations in the permeability of the vessel walls. The current in vitro methods to assess the radiation damage to the microvasculature make use of microfluidic device in which the endothelial cells, along with support cells such as fibroblasts, are seeded. The endothelial cells, which are dispersed in a tridimensional matrix, assemble themselves into perfusable capillary networks. As of today, the most used type of endothelial cell that is used for the generation of microvascular constructs originates from the human umbilical cord vein (HUVECs). The reason behind their widespread use is that these cells have the capacity to easily assemble into perfusable microvascular constructs. On the other hand, HUVECs are not endothelial cells that form the human microvasculature, therefore their response to radiotherapy may be different from the response that is obtained by irradiating different kinds of endothelial cells. From this hypothesis stems the need to obtain a model of the human microvascular network that is more appropriate than the one obtained with HUVECs. However, very few studies have addressed the possibility to generate microvasculature with other kinds of endothelial cells. To address this problem, a Design of Experiments approach was exploited in order to find the optimal condition for the obtainment of perfusable microvascular constructs with Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMECs). The Design of Experiments approach is a statistical tool that allows to determine the effects of multiple treatment factors and their interactions on a response variable. The factors that were taken into consideration are the concentration of endothelial cells in the specimen, the ratio of endothelial cells over fibroblasts, the concentration of fibrinogen used for the generation of the fibrin matrix and the quantity of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) supplied to the co-coltures. The work consisted in three main steps which were used for the identification of the factors that have a significative impact on the generation of the microvascular networks. The first step is a screening experiment that is used to identify those factors that do not have a correlation with any change on the parameters that define the microvascular networks. The values of the treatment factors were based on literature data. The screening design was performed in a simplified experimental condition with respect to the microfluidic device in order to easily identify the factors of interest. The second step consists in a full analysis of the remaining treatment factors. The reduced number of factors allows the generation of a complete experimental design that takes into consideration all the combinations of the factor levels, therefore it can determine wether two or more factors interact with each other to induce a significative change in the response of the microvascular network. This step highlights the effects of the factors, shedding light upon the complex environment in which the microvasculature is being generated. As for the first step, this part of the work was performed in a simplified condition. The third and last step makes use of a microfluidic device in which the cells are seeded. The treatment factors are the same of the ones used in the second part of the work, with the addition of the evaluation of the effects of a pressure drop, which is impossible to determine without the use of microfluidic devices. In addition to the in vitro part, a computational approach was exploited to evaluate the effects of the kinetics of VEGF in the microfluidic device. The former proposed model makes use of a diffusion-reaction equation that takes into account the production and degradation of VEGF in the co-colture and the binding of VEGF to the receptors found on the endothelial cells VEGFR-1 and VEGFR-2. The degradation rate and the binding-unbinding kinetics of VEGF were obtained from literature data, while the production rates were obtained experimentally with the use of an ELISA assay. A second simulation, which takes into account the pressure difference applied to the microfluidic device, was performed in order to obtain the necessary data for the optimal construction of culture medium reservoirs that allowed to maintain a constant pressure drop over time. Finally, the experimental setups have been discussed, along with their limitations. This work has paved the way for a change of paradigm in support to the current research activities on the effect of radiotherapy on the microvasculature.

Il danno da radiazioni causato dalla radioterapia sulla microvascolatura è uno dei problemi che attualmente i pazienti oncologici devono affrontare. Le principali alterazioni causate dalle radiazioni alla struttura del microcircolo sono apoptosi, morte o senescenza indotta dal danno al DNA delle cellule endoteliali e alterazioni nella permeabilità delle pareti dei vasi. Gli attuali metodi in vitro per valutare gli effetti del danno da radiazione sul microcircolo si basano sull'uso di dispositivi microfluidici in cui le cellule endoteliali, assieme ad altre cellule di supporto come i fibroblasti e a una matrice tridimensionale, vengono seminate. Le cellule endoteliali si assemblano, generando costrutti microvascolari perfondibili. Ad oggi, il tipo di cellule endoteliali che viene utilizzato maggiormente per la generazione di reti microvascolari proviene dalla vena del cordone ombelicale (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, o HUVECs). Tali cellule endoteliali sono utilizzate a causa della loro robustezza e dalla loro capacità di generare microvascolatura perfondibile. Tuttavia, le HUVECs non sono cellule endoteliali che formano la microvascolatura adulta. La loro risposta alle radiazioni potrebbe dunque essere differente da quella delle cellule endoteliali che si trovano fisiologicamente nel corpo umano. Da questa ipotesi nasce il bisogno di ottenere un modello di microvascolatura umana che sia più appropriato rispetto a quello ottenuto con le HUVEC. Nonostante ciò, sono pochi gli studi che hanno studiato la possibilità di generare reti capillari utilizzando cellule endoteliali differenti. Il problema di ottenere un protocollo per la generazione di costrutti microvascolari perfondibili utilizzando cellule endoteliali microvascolari dermali umane (HDMECs) è stato affrontato mediante un approccio sperimentale "Design of Experiments" (DoE). Il DoE è uno strumento statistico che permette di determinare gli effetti di molteplici fattori delle loro interazioni sui risultati di un esperimento. I fattori che sono stati presi in considerazione sono la concentrazione di cellule endoteliali nei campioni analizzati, il loro rapporto in volume rispetto ai fibroblasti, la concentrazione di fibrinogeno utilizzata per la generazione della matrice di fibrina e la quantità di VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor, fattore di cresciata dell'endotelio vascolare) aggiunta al mezzo di coltura. Il lavoro proposto consiste in tre punti principali, che sono stati utilizzati per l'identificazione dei fattori che hanno un impatto significativo sulla generazione delle reti microvascolari. Il primo passo si tratta di un esperimento di selezione ed eliminazione dei fattori che non presentano alcuna correlazione con i risultati sperimentali. I livelli dei fattori utilizzati in questa fase sono basati su dati di letteratura. L'esperimento è stato condotto in condizioni sperimentali semplificate rispetto a quelle del dispositivo microfluidico in modo tale da indentificare i fattori di interesse da quelli non significativi. La seconda parte del lavoro consiste in una analisi completa dei fattori rimanenti. Il numero ridotto di fattori rispetto alle fasi iniziali del lavoro permette di valutare gli effetti prodotti da tutte le combinazioni di fattori sulla generazione della microvascolatura. Questo passo del lavoro ha permesso di identificare le eventuali interazioni tra i fattori, in modo tale da studiare le complesse interdipendenze tra le variabili che giocano un ruolo chiave nella formazione di tessuto microvascolare. Similmente alla prima parte dell'esperimento, anche questo esperimento è stato eseguito in condizioni semplificate. La terza ed ultima fase del lavoro consiste nello studio della generazione di microvascolatura perfondibile nei dispositivi microfluidici utilizzando uno schema sperimentale che tiene conto degli stessi fattori della seconda parte del lavoro, in modo tale da valutare se vi sono differenze nella generazione delle reti microvascolari rispetto alle condizioni semplificate. In aggiunta, sono stati valutati gli effetti di una differenza di pressione applicata agli estremi del dispositivo. Quest'ultimo fattore è l'unico che non sarebbe stato possibile da valutare senza l'uso di un dispositivo microfluidico. Per valutare gli effetti del VEGF all'interno del dispositivo microfluidico, è stato utilizzato un modello computazionale che tiene conto della cinetica del VEGF. Il modello proposto utilizza un modello di diffusione-reazione del fattore di crescita. In particolare si è tenuto conto della produzione e degradazone del VEGF nelle co-colture e della cinetica di legame del VEGF con i recettori VEGFR-1 e VEGFR-2. I parametri di degradazione del VEGF e della cinetica di legame sono stati ottenuti da dati di letteratura, mentre i valori di produzione del VEGF sono stati ottenuti sperimentalmente mediante l'utilizzo di un saggio ELISA. In aggiunta è stata condotta una simulazione della fluidodinamica del mezzo all'interno del dispositivo microfluidico, in modo tale da ottenere i dati necessari per la costruzione di un reservoir per il mezzo di coltura che permettesse di mantenere una differenza di pressione costante per lunghi periodi di tempo. Infine, le condizioni sperimentali sono state discusse e se ne sono valutati i limiti. Questo lavoro ha permesso di aprire la strada verso un cambio di paradigma nell'ambito della generazione di reti microvascolari in vitro da utilizzare nello studio degli effetti della radioterapia sul tessuto capillare umano.