Formulated hydrogels for colorectal cancer treatment

Adenocarcinoma of the colon is the most common malignant neoplasia of the gastrointestinal tract and is a major contributor to mortality worldwide. With 50000 deaths/y in the US [Harrison’s principles of internal medicine (2015)] and 20000 deaths/y in Italy [Ministero della Salute (2016)], colorectal adenocarcinoma is second for cancer lethality. Invasiveness and metastatic behavior are typical of malignant tumors and, because of its portal drainage, liver is the closest capillary bed available in this case, hence the common site of metastatic lesions. Current therapies forecast total resection of primary tumor when possible and partial liver resection at advanced stages, along with systemic intravenous therapies consisting of chemotherapeutic agents such as 5-fluorouracil. These cures are definitely not exempt from drawbacks and heavy side effects. Immunotherapy with interferons, able to trigger the adaptive immune system downregulated by surgery, is a new frontier but must be administrated locally and with a constant concentration prolonged in time. This should help healing colorectal cancer and avoiding its spreading to the liver, a major concern. From here comes the necessity to develop alternative controlled liver- and colon-targeted drug delivery systems. Furthermore, since it is well known that cancer in each patient is unique, the need for a precision therapy is highlighted, focusing on the identification of specific drivers and vulnerabilities, including intra-tumor heterogeneity, related to cancer in an individual patient. San Raffaele Hospital, with AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro) support, set up a project aimed to develop a novel hydrogel scaffold suitable for intraoperative placement: “Type I interferon subtypes with high in vivo potency for the treatment of liver colorectal cancer metastases”. This thesis work constitutes the phase I, dealing with the new material identification, synthesis and characterization for a proper extended drug release. Biocompatible hydrogels – polymeric networks able to absorb large quantities of water and load a variety of molecules – belong to the class of innovative drug delivery systems, thus suitable for this purpose and tunable on each patient. Implantation of a polymeric scaffold easy to synthesize can substitute chemotherapy and combination therapies scheduling, shortening side effects. Moreover, it does not require a surgical removal thanks to spontaneous degradation and guarantees an extended and regional cargo release, maintaining high drug concentrations. Starting from the widely studied agarose – carbomer hydrogels, modification with hyaluronic acid of three molecular weights and in different proportions was performed, creating a spectrum of nine possible formulated blends to be tested. The introduction of a spacer in terms of a different polymer was thought to extend the mesh size and tune the crosslinking density of the network, allowing larger molecules loading. On the other side, carbomer was maintained in the formulation for a better solidity and degradation timing, along with the demonstrated good influence on hydrogel structure thanks to the interactions with hyaluronic acid. The project’s core was the material characterization, with tests for hydrogels’ chemical structure, microscopical morphology, swelling kinetics, degradation in an enzymatic environment and drug release with fluorescent tracers. The mimetic drugs employed were fluorescein and high-molecular weight fluorescein isothiocyanate-dextran, which resemble small cytokines and large interferons respectively. Results were modelled for obtaining structural parameters, as the mesh size formed by the polymeric network, and the mass transport regime, including diffusion coefficients evaluation. The accomplished proofs were compared with those achieved from the simple agarose – carbomer samples to highlight the improvements. Additionally, an alternative formulation constituted by 4arm PEG amine and high-molecular weight hyaluronic acid was tested with the same goal. Not focusing on a single material is fundamental in the novel drug delivery systems field. Eventually, best formulation selection process will be carried out on the basis of several features, among which release power and dissolution period, including handling easiness, are the most important ones.

L’adenocarcinoma del colon è la neoplasia maligna più comune del tratto gastrointestinale ed uno tra i principali fattori mondiali di mortalità. Con 50000 morti/anno negli Stati Uniti [Harrison’s principles of internal medicine (2015)] e 20000 morti/anno in Italia [Ministero della Salute (2016)], l’adenocarcinoma del colon-retto è secondo come letalità tra le morti per cancro. L’invasività e il comportamento metastatico sono tipici dei tumori maligni. In questo caso il fegato, ovvero l’organo limitrofo maggiormente vascolarizzato, a causa del suo drenaggio portale, risulta essere il sito più comune per la diffusione delle cellule tumorali e per l’attecchimento di metastasi. I trattamenti attuali prevedono, quando è possibile, la resezione del tumore primario e la rimozione parziale del fegato negli stadi più avanzati. Assieme alla chirurgia, viene eseguito un percorso di terapie sistemiche endovenose con agenti chemioterapici, come il 5-fluorouracile. Tali trattamenti non sono certamente esenti da rilevanti aspetti negativi ed effetti collaterali pesanti. L’immunoterapia tramite interferoni, capaci di attivare il sistema immunitario adattivo che viene parzialmente inibito con l’intervento chirurgico, è una frontiera innovativa nel campo delle cure per il cancro al colon-retto e le relative metastasi epatiche, ma deve essere somministrata localmente con concentrazioni costanti e protratte nel tempo. Questa cura potrebbe aiutare a ridurre la neoplasia e, fattore di primaria importanza, a evitare il coinvolgimento del fegato. Ecco dunque la necessità di sviluppare nuovi sistemi per il rilascio controllato di farmaci che abbiano come target specifico il colon e/o il fegato. Inoltre, dato che il cancro in ogni paziente si comporta in modo unico, appare evidente il bisogno di terapie di precisione, mirate all’identificazione delle vulnerabilità e della specifica eterogeneità intra-tumorale legate alla malattia neoplastica in ogni individuo. L’Ospedale San Raffaele, con il supporto di AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro), ha avviato un progetto finalizzato a sviluppare una nuova impalcatura di idrogeli adatta all’impianto intraoperatorio: “Type I interferon subtypes with high in vivo potency for the treatment of liver colorectal cancer metastases”. Questo lavoro di tesi costituisce la fase iniziale di tale progetto, occupandosi dell’identificazione, sintesi e caratterizzazione di un nuovo materiale in grado di rilasciare gradualmente i farmaci di cui è stato caricato. La classe degli idrogeli biocompatibili – ossia strutture polimeriche in grado di assorbire ingenti quantità di acqua e di caricare svariate tipologie di molecole – appartiene ai sistemi innovativi per il rilascio controllato di farmaci, adatti di conseguenza al nostro scopo e regolabili sul singolo paziente. L’impianto di un’impalcatura polimerica facile da sintetizzare può sostituire la chemioterapia e la programmazione di terapie combinate, riducendone gli effetti collaterali. Inoltre, essa non richiede la rimozione per via chirurgica grazie al degrado e riassorbimento spontaneo, oltre al fatto di garantire un rilascio del carico esteso nel tempo e localizzato nello spazio, mantenendo alte concentrazioni dove necessario. Partendo da idrogeli di carbomer e agarosio, è stata effettuata una modifica con acido ialuronico di tre diversi pesi molecolari utilizzati in differenti proporzioni, creando uno spettro di nove possibili formulazioni da testare. L’introduzione di un distanziatore sotto forma di differente polimero è stata pensata per allargare la dimensione delle maglie della rete e ottimizzare la densità di crosslinks, permettendo il caricamento di molecole dalle dimensioni maggiori. Dall’altro lato, nella formulazione è stato conservato anche il carbomer per assicurare una miglior solidità e un giusto tempo di degrado, nonché mantenere l’influenza positiva che esso dimostra nei confronti della struttura del gel grazie alle interazioni con l’acido ialuronico. La caratterizzazione del materiale ha costituito il cuore del progetto, con test per la valutazione della struttura chimica, della morfologia microscopica, della cinetica di swelling, del degrado enzimatico e del rilascio di farmaci mimetici con proprietà fluorescenti. Per l’ultima prova sono stati utilizzati fluorofori come la fluoresceina e la fluoresceina-destrano ad alto peso molecolare, i quali ricalcano rispettivamente le dimensioni di citochine e interferoni. I risultati sono stati ulteriormente modellati per ottenere parametri strutturali, come la dimensione delle maglie formate dalla rete polimerica, e il regime di trasporto di massa, contando anche sulla valutazione dei coefficienti di diffusione. Le prove riportate sono state confrontate con le medesime svolte per i gel semplici di carbomer e agarosio, al fine di evidenziare le migliorie. Da ultimo, è stata vagliata ed esaminata con gli stessi test una formulazione alternativa composta da PEG ammina a 4 braccia e acido ialuronico ad alto peso molecolare, mantenendo fisso lo scopo ultimo del lavoro. Questo perché nel campo della ricerca di nuovi sistemi per il rilascio controllato di farmaci è necessario non focalizzarsi solo su un unico materiale. Infine, il processo di selezione della formulazione migliore sarà svolto sulla base di diversi parametri, i più rilevanti saranno: l’efficienza di rilascio, il periodo di degradazione, nonché la facilità di manipolazione.