Bioprinting of matrigel-based scaffolds for long-term cell cultures : study of the dispensing system

Colorectal cancer is one of the most lethal types of cancer, and its death toll amount to over 1.8 million yearly. Several therapies are available to treat cancer patients, however most of them still presents major drawbacks. The tumor can be removed through surgery, ablation or radiation therapy at early stages, while for later stages strategies like chemotherapy or immunotherapy are used to cure the patients. None of these approaches is completely safe, and it is very hard to target the tumor without damaging the patient body or the surrounding tissues. In addition, the tumor is not always completely removed, and the cancer cells left in the body can develop into new metastatic sites. To be able to improve and develop new treatments for colorectal cancer, it is crucial to create effective in vitro models that are capable to accurately reproduce cells behavior. This can be useful to obtain a low-cost screening platform for drug therapies, as well to study the spreading and proliferation of cancer cells. The use of reliable in vitro models can prevent unexpected effects of drugs after in vivo testing, allowing to save remarkable amounts of economic resources by avoiding to fail the drugs validation tests. Among all of techniques of fabrication of in vitro models, bioprinting presents several advantages. It combines a high reproducibility of constructs, a low contamination percentage and a high resolution in cell deposition. It makes possible to recreate structures with complex geometry, and it allows to reproduce an optimal environment for cell growth and proliferation. The aim of this thesis work is to optimize the bioprinting process of Matrigel, in order to implement a process capable of producing scaffolds that allow the study of long-term in vitro cell cultures of colorectal cancer. Matrigel is a gelatinous protein mixture derived from mouse tumor cells. It is often used in cell cultures for its capabilities to maintain cell vitality for extended periods of time, allowing to perform experiments that can last up to several days. However, Matrigel presents sub-ideal rheological proprieties for bioprinting. For this reason, it is often mixed with others bioinks to obtain a material with ideal mechanical and biological proprieties. In order to bioprint Matrigel, it was mixed with alginate/gelatin blends. Several alginate/gelatin blends were prepared to find a combination of concentrations that could allow a good quality print. These blends were then tested and printed on the bioprinter Cellink Inkcredible+. The results of the printing process where then analyzed, and the best results were obtained by using a blend composed by 4.5%/6.5% w/v alginate/gelatin. Once the ideal alginate/gelatin blend was identified, it was mixed in different concentration with Matrigel. The resulting bioink, composed by alginate/gelatin/Matrigel, was printed as well. The results were then studied to define the concentration that had the better mechanical and biological properties. It was also attempted to bioprint pure Matrigel. It is very difficult to bioprint Matrigel on a standard pressure-driven bioprinter. This happens mainly because the extrusion is performed by applying a fixed pressure on the bioink, and consequently it is hard to accurately control the bioink flow rate. A 3D printer (model Prusa I3) was modified in a way that allowed the bioink extrusion through the application of a controlled displacement on the plunger of a syringe mounted on the printer extruder. The modifications made possible to bioprint simple three-dimensional Matrigel structures. For both printers (Prusa I3 and Cellink Inkredible+) printing parameters were studied and optimized. Flow rate, pressures, printing speed, nozzle dimensions and geometries were analyzed in order to find the optimal combination to perform the bioprinting process. To improve the mechanical properties of the constructs, a crosslinking process with CaCl2 is necessary. Different crosslinker concentrations, crosslinking times and crosslinking strategies were analyzed in order to select the optimal one. Several swelling and degradations tests were carried out as well, with the aim of studying the behavior of the bioprinted constructs over several days. These studies were carried out by analyzing how structures made by different bioinks and crosslinked with different CaCl2 concentration would react after being immersed in PBS for several days. Lastly, a computational analysis regarding the bioink behavior inside the cartridge was carried out. The first step was to define the rheological properties of the bioink. To do so, the flow rate of the bioink at different pressures was measured. The results obtained where then confronted and fitted with a Hershel-Buckley analytical model of viscosity. Thanks to this process, it was possible to extract the bioink rheological parameters. These parameters were then used to perform several computational simulations with the software ANSYS Fluent. The flow of the bioink was simulated in nozzles of different size and shape, and several values such as pressure, wall shear stress, strain rate and velocity were extracted from each simulation. These values were then compared with values found in literature in order to predict the cell vitality after the printing process.

Ogni anno circa 1,8 milioni di persone muoiono a causa di cancro colorettale, rendendo questa patologia una delle più letali a livello mondiale. Esistono diverse terapie per trattare questo tipo di cancro, tuttavia tutti gli approcci fino ad ora conosciuti presentano problematiche significative. Negli stadi meno avanzati della patologia è possibile agire localmente sul tumore, rimuovendolo chirurgicamente o tramite radioterapia. Se la malattia è a un livello già progredito viene invece trattata tramite chemioterapia o immunoterapia. Purtroppo, nessuno di questi approcci è totalmente sicuro, e in tutti i casi è molto difficile rimuovere il tumore senza danneggiare il paziente. Spesso le cure si rivelano inefficaci, e le cellule di tumore sopravvissute alle terapie possono nuovamente proliferare e far regredire la patologia. Per poter migliorare il trattamento del cancro al colon, è necessario creare modelli in vitro capaci di riprodurre fedelmente il comportamento cellulare. Lo scopo di creare modelli in vitro affidabili è quello di ottenere una piattaforma a basso costo per drug-screening e che allo stesso tempo permetta di studiare la proliferazione e il metabolismo delle cellule cancerogene. L’uso di modelli in vitro accurati può inoltre portare al risparmio di risorse economiche notevoli durante il processo di sviluppo di un farmaco, evitando che il farmaco dia effetti inaspettati una volta testato in vivo e che di conseguenza renda necessario far ripartire da zero la ricerca. Tra le tecniche di fabbricazione di modelli in vitro, il bioprinting presenta diversi vantaggi. Esso rende possibile un’alta precisione e riproducibilità dei costrutti, una bassa percentuale di contaminazione e un’alta risoluzione nella deposizione di cellule. È possibile ricreare strutture dalla geometria complessa e di conseguenza ricreare un ambiente ottimale per la proliferazione cellulare. Lo scopo di questo lavoro di tesi è l’ottimizzazione del processo di bioprinting del Matrigel, al fine di implementare un processo che renda possibile la produzione di scaffold per studi in vitro a lungo termine di colture di cellule di cancro colorettale. Il Matrigel è una matrice extracellulare gelatinosa e ricca di proteine che viene estratta dalle cellule tumorali di topo. Viene spesso utilizzato nelle colture cellulari grazie alla sua capacità di garantire una buona vitalità cellulare per lunghi periodi di tempo e permettendo studi della durata di diversi giorni. Tuttavia, il Matrigel presenta caratteristiche reologiche particolari, che lo rendono difficile da usare allo stato puro in un processo di bioprinting. Per questo motivo è spesso miscelato con altri bioink al fine di ottenere un materiale con capacità meccaniche e biologiche ottimali. Per poter rendere possibile la stampa di Matrigel sono stati testati diversi blend di alginato e gelatina con cui il Matrigel è stato poi miscelato. Tali blend sono stati impiegati in processi di bioprinting sulla stampante Cellink Inkredible+. I risultati sono stati analizzati al fine di definire la concentrazione di alginato e gelatina ideale. La combinazione di concertazioni migliore è risultata essere un blend 4,5%/6,5% w/v di alginato/gelatina. Una volta definite le percentuali ottimali di alginato e gelatina, il blend è stato miscelato con diverse concentrazioni di Matrigel. Per ogni blend alginato/gelatina/Matrigel preso in considerazione è stata poi caratterizzata l’accuratezza di stampa. É stata anche presa in considerazione la stampa di Matrigel puro. Dal momento che con una bioprinter controllata in pressione non è possibile stampare Matrigel, una stampante 3D tradizionale (di modello Prusa I3) è stata appositamente modificata per la stampa di Matrigel puro. Le modifiche sono state volte a rendere possibile l’estrusione del bioink tramite controllo volumetrico, applicando un determinato spostamento allo stantuffo della siringa montata sull’estrusore della stampante. In questo modo il flow rate del bioink durante il processo di stampa può essere controllato in modo accurato, a differenza di quanto avviene in una bioprinter tradizionale, dove una pressione fissa è applicata alla cartuccia contenente il bioink. In questo modo è stato possibile stampare Matrigel puro. Per entrambe le stampanti utilizzate (Prusa I3 e Cellink Inkredible+) è stato svolto uno studio dei parametri di stampa. Sono stati analizzati flow rate, pressione, velocità di stampa, dimensione e tipo degli aghi utilizzati al fine di ricavare i valori ottimali con cui svolgere il processo. Per poter ottenere costrutti con una determinata rigidità strutturale, è necessario attuare un processo di crosslinking dell’alginato con CaCl2. Diverse concentrazioni, tempi e strategie di crosslinkig sono state analizzate. La strategia ottimale è risultata essere quella di reticolare il costrutto dopo il processo di stampa con una soluzione 0,15 molare di CaCl2 per due minuti. Sono state svolte diverse prove di degradazione e rigonfiamento al fine di studiare il comportamento degli scaffold nell’arco di diversi giorni. Costrutti con diverse geometrie, combinazioni di bioink e reticolati con diverse concentrazioni sono stati immersi in PBS e monitorati nel corso di una settimana. Infine, è stata svolta un’analisi computazionale sul processo di stampa per poter studiare il comportamento del bioink di alginato e gelatina all’interno della cartuccia. Come primo step, il flow rate del bioink è stato misurato sperimentalmente al variare della pressione. La curva ottenuta è stata poi confrontata con una curva derivata dal modello analitico di viscosità di Hershel-Bulkley, e tramite una procedura di fitting è stato possibile estrarre i parametri reologici del bioink. Tali parametri sono stati utilizzati in simulazioni computazionali grazie al software ANSYS Fluent. In questo modo è stato analizzato e confrontato il comportamento del bioink in aghi di varia dimensione e forma. Grazie ai risultati delle simulazioni, è stato possibile analizzare i valori di strain rate e wall shear stress - che possono influire drasticamente sulla vitalità cellulare – e confrontarli con i valori trovati in letteratura.