Design and development of a filterless spectrofluorometer

The recent growth of fluorescence techniques as research tools in biochemistry and biophysics led to the development of more precise and sophisticated systems, so that fluorescence is now widely used in various fields like environmental monitoring, clinical chemistry, DNA sequencing, and also in enzymelinked immunoassays. In particular, fluorescence spectroscopy is a spectroscopic technique with the ability to fully characterize very small amounts of sample with a simple instrument named spectrofluorometer, generally composed by a light source, a sample chamber, a photodetector and optical filters or monochromators. However, the continuous demand for sensitive and performing tools has given rise to complex and refined systems that cannot always be used on site; as a result, new technologies called LoC (Lab on Chip) are becoming increasingly important due to their low cost and portability. In this thesis we present a first prototype of a filterless spectrofluorometer, whose purpose is to bring together the need for a high sensitivity instrument with the possibility of being portable, inexpensive but effective. The innovation lies in the choice of a new generation photodetector with high performance and efficiency, the Silicon Photomultiplier (SiPM), and in the absence of optical filters, whose shielding effects will be replaced by a modulation circuit of the photodetector voltage bias. The design focused on the hardware development of the SiPM bias voltage modulation circuit and on the synchronization of the signals that regulate its operation using a microcontroller and programmable delay lines, thanks to which it was possible to delay one signal with respect to another even only by 1 ns. Taking advantage of the PWM output function of the programmable delay, a LED pulsing circuit with 10 ns pulses synchronized with the SiPM modulator was also implemented, so that the falling edge of the pulse was positioned exactly at 20 ns from the rising edge of the SiPM turn on signal. Finally, part of the work was dedicated to the design of a first prototype of a microfluidic channel used for static measurements.

La recente crescita delle tecniche di fluorescenza come strumenti di ricerca in biochimica e biofisica ha portato allo sviluppo di sistemi sempre più precisi e sofisticati, così che la fluorescenza sia ora ampiamente utilizzata in vari campi come nel monitoraggio ambientale, in chimica clinica, nel sequenziamento del DNA e anche in saggi immunologici collegati agli enzimi. In particolare, la spettroscopia di fluorescenza è una tecnica spettroscopica con la capacità di caratterizzare completamente quantità molto piccole di campione con un semplice strumento chiamato spettrofluorimetro, generalmente composto da una sorgente di luce, una camera contenente il campione, un fotorilevatore e filtri ottici o monocromatici. Tuttavia, la continua richiesta di strumenti sensibili e performanti, ha dato vita a sistemi complessi e raffinati non sempre utilizzabili in loco; di conseguenza, nuove tecnologie chiamate LoC (Lab on Chip) stanno acquisendo sempre più importanza grazie al loro basso costo e portabilità. In questa tesi si presenta un primo prototipo di spettrofluorimetro senza filtri, il cui scopo è quello di coniugare l'esigenza di uno strumento ad alta sensibilità con la possibilità di essere portatile, economico ma efficace. L'innovazione sta nella scelta di un fotorilevatore di nuova generazione ad alte prestazioni ed efficienza, il Silicon Photomultiplier (SiPM), e nell' assenza di filtri ottici, i cui effetti di schermatura saranno sostituiti da un circuito di modulazione della tensione di polarizzazione del fotorilevatore. La progettazione si è concentrata sullo sviluppo hardware del circuito di modulazione della tensione di polarizzazione del SiPM e sulla sincronizzazione dei segnali che ne regolano il funzionamento utilizzando un microcontrollore e delle linee di ritardo programmabili, grazie alle quali è stato possibile ritardare un segnale rispetto ad un altro anche di un solo nanosecondo. Sfruttando la funzione d'uscita PWM del ritardo programmabile , è stato anche implementato un circuito LED con impulsi di durata di 10 ns sincronizzato con il modulatore SiPM, in modo che il fronte di discesa dell'impulso fosse posizionato esattamente a 20 ns dal fronte di salita del segnale di accensione del SiPM. Infine, una parte del lavoro è stata dedicata alla progettazione di un primo prototipo di canale microfluidico utilizzato per misurazioni statiche.