Development of a staining methodology for perfusion experiments on 3D bio-printed scaffolds : an experimental and computational approach

Introduction- Critical size bone defects is still an open issue in the field of Tissue Engineering. Nowadays, even defining this pathology is not trivial. One definition, on which several scientific communities agree is ”Defect that does not heal spontaneously, even after surgical fixation and needs further surgical interventions” [1]. Due to the lack of information regarding the location of the defect, the conditions of the surrounding tissues and potential co-morbidities, finding a treatment is not straightforward. In the tissue engineering area, a promising approach to treat this disease, could be the use of cell-laden 3D Bio-printed scaffolds. These scaffolds can be tailored for the patient using 3D Bio-printing, a layer by layer printing deposition of specific materials called bio-inks. Depending on which tissue has to be reproduced, different materials, often polymers, are available. For bone defects, Alginate is frequently combined with Gelatin. The combination of these two materials shows encouraging results in terms of biocompatibility, printability and cross-linking stability. Recent studies ([2, 3]), highlight great potential in the use of Graphene Oxide to improve the mechanical properties of the Alginate-Gelatin blend. Bio-printing allows to obtain porous scaffolds with different types of geometries and a high level of shape fidelity between the CAD (Computer Aided Design) model and the real structure. Usually, the scaffolds are seeded with cells, that are cultivated to trans- form into osteoblasts and then osteocytes. μCT is used to monitor the level of mineralization during time [4, 5]. Traditionally μCT evaluation is conducted one month after seeding, in order to be able to start seeing mineralization formation. Doing this allows to visualize only the mineralized part of the scaffold, not the entire structure (hydrogel and scaffold). This is explained by a different X-ray attenuation coefficient between the mineralized part of the scaffold and hydrogel one. However, it would be interesting to assess the complete structure starting from the very first point until the complete mineralization. To do so, a staining methodology for the scaffold needs to be developed. This was the first goal of this project that comes from a previous study conducted by Valerio Luca Mainardi, whose aim was to investigate the effect of fluid-dynamic stimulation of 3D bio-printed structures using a combination of experimental and computational approach. In particular, he performed CFD (Computational Fluid-dynamic) simulations on the CAD model, with the goal of examining different flow-rates to simulate the perfusion cultivation conditions on the scaffold. Then he selected the most promising flow-rates, depending on the wall shear stresses produced by them. In this thesis the development of the staining methodology is applied to replicate the CFD simulations on the real structure of the scaffold, acquired using μCT scans. Furthermore, a mechanical and cell viability assessment has been conducted to evaluate the selected geometry and the printing process in comparison with existing alternatives. Lastly, investigations on cell morphology and cell density have been performed on the scaffolds subjected to 6 weeks perfusion cultivation. Materials and Methods- The experiments performed in this project can be divided in two groups. Experiments in the former group were carried out on day 0 (staining methodology, cell viability, mechanical tests, geometrical measurements), right after printing by using two inks: 0.8% Alginate- 4.1%Gelatin (AlgGel) and 1 mg/ml Graphene Oxide (1GO). Those in the latter group were carried out on the scaffolds prepared in a previous work [6] by subjecting them to six week perfusion cultivation (histology, immunohistochemistry assays), only Alginate Gelatin. The experimental setup for the perfusion cultivation reported in Figure 9 was developed by V.L. Mainardi [6]. Due to geometry constraints, a cylindrical geometry for the scaffold has been selected. The CAD model has been optimized to achieve the best results in terms of printability and shape fidelity. In the end, the version that showed the best outcome (Figure 10) is the one with a diameter of 10 mm and height of 3 mm. The development of the staining methodology was based on the need to have a substance easily removable, biocompatible, not influencing the gelation process of the bio-ink, with a good X-ray attenuation coefficient and not compromising cell viability. Taking into account these requirements, the staining of the control medium was the only available solution. After a literature review, Dotarem was selected as contrast agent. It is a Gadolinium based MRI contrast agent for humans. The scaffolds were printed using 3D Bio- printer at ETH Zurich, Switzerland, with two different bio-inks: AlgGel and 1GO, then placed in a static bioreactor and the solution, made of control medium and Dotarem in different concentrations was added. Next, the scaffolds were scanned with μCT and the reconstructions were used to acquire the structure’s details and employed to perform the CFD simulations using COMSOL. In order to evaluate the mechanical properties of the cylindrical geometry made of the two different materials, compressive uniaxial mechanical tests were performed with the Zwick testing machine. The machine registered the force displacement data, that were converted into stress-strain curves, from which the elastic modulus was extrapolated. The cell viability evaluation has been conducted using a fluorescence-based staining with Calcein and Ethidium Homodimer [7]. The cell morphology and cell density has been evaluated with histology and immunohistochemestry assays with specific stainings, respectively Hematoxylin and Eosin, Sirius Red and Alizarin Red for the histology and Osteocalcin and Sclerostin for the immunohistochemistry [8, 9]. Results and Discussion- Several concentrations of Dotarem have been tested for the staining methodology, but they all led to the same result as Figure 11 shows. The contrast agent is quickly diffusing into the scaffold’s material during the scanning time (45 minutes). Dotarem was not working as expected, therefore a different approach was experimented. A scan without solution (just the scaffold) was performed and we noticed similar intensity of grey level for the scaffold and the control medium, so we realised that we needed to get rid of the control medium to be able to observe the structure details. Hence, we dried the scaffold before scanning it, by placing Kimtech wipes on top and on bottom of the scaffold. The result of the ”dried” scan is reported in Figure 12 and it shows a greater amount of details of the structure with respect to the scan per- formed with Dotarem. The μCT reconstructions reported in Figure 13 and 14 respectively for AlgGel and 1GO have been carried out using the drying method. Figure 13 and 14 depict structures with visible and clean pores. In order to quantify the shape fidelity of the printing process, geometrical parameters have been measured from stereomicroscope images of the scaffolds, taken right after printing. The analyzed parameters were: filament diameter, pore size and overall area. V.L. Mainardi performed the CFD simulations on the CAD model of the scaffold [6]. In this study we compared the level of prediction of the model with respect to the simulations run on the real structures in terms of homeostatic pressure, velocity of the fluid and wall shear stresses for two flow-rates: 0.7 ml/min and 7 ml/min using as control the static bioreactor experiment. The most significant results are shown in Table 4. Table 4 reports the results for the 7 ml/min flow-rate. For all the analyzed parameters, the model was able to predict quite accurately the results, but some differences can be noticed between the model and the real structures. For example, considering the homeostatic pressure, differences can be observed in the magnitude of the homeostatic pressure on the top surface of the AlgGel and 1GO structure (4 B-C), due to dissimilarity in the printing of the two scaffolds. The flow finds more resistance when trying to flow into the AlgGel scaffold, because of its smaller pores with respect to the 1GO structure. The velocity data highlight a different distribution of the streamlines between the model and the two scaffolds as a results of a higher irregularity of the real structures compared to the model’s one. Finally, the outcome of the CFD analysis run on the real structures underlines critical points in terms of shear stresses in the rear of the scaffolds. The mechanical testing confirms the higher stiffness of the 1GO scaffolds with respect to the AlgGel ones. The compressive mod- ulus, calculated as the slope of the linear part of the stress-strain curve in the 5-15% strain interval, after a linear interpolation, is respectively 1.8 kPa for the AlgGel and 3 kPa for the 1GO scaffolds. Figure 15 and 16 represents the stress-strain plots for the four samples analyzed for each ink. By observing the plastic part of the curve for both materials, we see a dispersion of the results, probably caused by a not highly reproducible printing process. The CFD simulations underlined differences in several parameters between the top and bottom surface of the scaffolds, therefore a differentiated analysis between top and bottom sections was carried out also from a histological and immuno-histochemistry point of view. Table 5 contains complementary information about the top sections of the scaffolds at day 42: the histology analysis highlights the hydrogel com- ponent of the scaffold, emphasizing different elements depending on the staining, the μCT scans reports the mineralization formation at the same time point: day 42. The staining methodology developed in this project would give both over-mentioned information with a single analysis. By comparing the two flow-rates (0.7 ml/min and 7 ml/min) with the control (static group) it is evident that the faster the velocity, the higher the mineralization rate. The immunohistochemistry assay have been conducted to assess the cell growth-stage after six weeks of perfusion cultivation, using two proteins (osteocalcin and sclerostin) that are expressed respectively from osteoblasts and mature osteocytes. Table 6 illustrates the bottom sections of the samples subjected to six weeks of perfusion cultivation. From the absence of the Sclerostin signal in the staining we can conclude, on one hand, that probably six weeks were not enough to develop mature osteocytes, on the other hand this cultivation time was sufficient to obtain osteocalcin expression, indicating presence of osteoblasts. The 7 ml/min group highlights a change in shape of cells with elongated structures, indicating probably a development from osteoblasts into osteocytes. Conclusions and future prospect- In this study we developed a staining methodology that has been tested on acellular scaffolds, therefore a cell viability test should be performed to assess its efficiency on cell-laden scaffolds. The CFD simulations conducted on the real structures report similar results with respect to the ones predicted by the model, indicating correctness of the hypothesis of the COMSOL model. In general, we underline the great potential of the real structure that could take into account the effect of time, indicating potential changes of the hydrogel from day 0 until the mineralization process is taking place (ideally day 30). Furthermore, using the real structure could lead to a simultaneous assessment of the mineralization process and of the fluid-dynamics. From the cell viability and mechanical evaluations we showed that the cylindrical geometry, that we were forced to use due to geometrical constraints of the perfusion bioreactor, is a valid alternative to the existing ones. In the end, in order to be able to see expression of sclerostin in the immunohis- tochemistry assays, a longer cultivation time should be tested. In a future prospective, we suggest to perform a perfusion experiment also on 1GO scaffolds for a period longer than 6 weeks, ideally 8 to 10 weeks.

{Introduzione} I difetti ossei critici sono ancora una questione aperta nell'ambito dell'Ingegneria Tissutale. Al giorno d'oggi, anche trovare una definizione per questa patologia non è facile. Una fra le più accreditate dalle comunità scientifiche è la seguente: "Il difetto osseo critico è un difetto che non guarisce autonomamente, anche dopo una stabilizzazione chirurgica e ha bisogno di ulteriori interventi chirurgici" {1}. A causa della mancanza di informazioni riguardo la posizione del difetto, le condizioni dei tessuti circostanti ed eventuali comorbidità, individuare dei trattamenti non è un processo immediato. Nel campo dell'Ingegneria Tissutale, un approccio promettente per curare questa patologia, potrebbe essere l'utilizzo di scaffold stampati in 3D seminati con cellule. Fra i numerosi vantaggi di questo approccio, c'è la possibilità di personalizzare lo scaffold per il paziente, utilizzando la tecnica della stampa 3D. Essa consiste nella deposizione sequenziale di strati di materiale, chiamato bio-ink. A seconda del tipo di tessuto che si vuole riprodurre, possono essere impiegati diversi materiali, molto spesso vengono scelti dei polimeri. In particolare, per i difetti ossei, l'Alginato è spesso combinato con la Gelatina. La combinazione di questi due materiali ha dimostrato risultati incoraggianti in termini di biocompatibilità, stampabilità e stabilità del processo di reticolazione. Studi recenti {2, 3}, evidenziano il grande potenziale dell'utilizzo dell'Ossido di Grafene per migliorare le propietà meccaniche del blend Alginato-Gelatina. Il bio-printing permette di ottenere scaffold con struttura porosa, dalle geometrie più disparate e mantenendo un buon livello di corrispondenza fra il modello CAD (Computer Aided Design) e la struttura stampata. Gli scaffold vengono seminati con cellule, in questo studio con cellule staminali mesenchimali umane, che vengono coltivate per trasformarsi in osteoblasti e poi in osteociti. La microCT è utilizzata per monitorare i livelli di mineralizzazione nel tempo {4, 5}. Generalmente la valutazione con la microCT è condotta all'incirca un mese dopo la semina, per essere in grado di iniziare a osservare la prima formazione di minerale. In questo modo però, si può osservare solo la parte mineralizzata dello scaffold e non l'intera struttura, costituita dall'hydrogel e dalla parte minerale. L'impossibilità di non vedere l'hydrogel con una microCT tradizionale è imputabile al differente coefficiente di attenuazione dei raggi X fra la parte mineralizzata dello scaffold e l'hydrogel. Infatti, sarebbe molto interessante poter avere una visione complessiva di entrambe le parti costituenti lo scaffold. A questo scopo, in questo studio si è approfondita una metodologia di colorazione dello scaffold. Questo era il primo obiettivo della tesi, che origina da uno precedente studio condotto da Valerio Luca Mainardi, che era finalizzato a investigare l'effetto della stimolazione fluidodinamica su strutture stampate in 3D utilizzando un approccio sperimentale e computazionale. Nel dettaglio, V.L. Mainardi ha svolto simulazioni CFD (Computational Fluid-dynamic) sul modello CAD, con l'obiettivo di esaminare differenti portate per simulare sullo scaffold la condizione di coltivazione in perfusione. Fra le varie portate, V.L. Mainardi ha selezionato le più promettenti in termini di sforzi di taglio prodotti In questa tesi, lo sviluppo della metodologia di colorazione è finalizzata al replicare le stesse simulazioni CFD, ma sulla struttura reale dello scaffold, acquisita utilizzando scansioni della microCT. Inoltre, valutazioni meccaniche e di vitalità cellulare sono state effettuate per esaminare la geometria cilindrica scelta insieme alla qualità del processo di stampa e i risultati ottenuti sono stati confrontati con quelli delle geometrie già esistenti. In fine, sono state analizzate la morfologia cellulare e la densità cellulare degli scaffold soggetti a 6 settimane di coltura a perfusione. {Materiali e Metodi} Gli esperimenti condotti in questo progetto possono essere divisi in due gruppi. Il primo gruppo consiste in quelli eseguiti al giorno 0 (metodologia di colorazione, vitalità cellulare, test meccanici, misurazioni geometriche), subito dopo la stampa utilizzando due inchiostri: 0.8% Alginato- 4.1%Gelatina (AlgGel) and 1 mg/ml Ossido di Grafene (1GO). L'altro gruppo è formato dagli esperimenti condotti sugli scaffold preparati in uno studio precedente {6} che sono stati sottoposti a 6 settimane di coltura in perfusione (istologia, immunoistochimica) solo con Alginato-Gelatina. Il setup sperimentale per la coltivazione a perfusione, riportato in Figura {Fig.0.1} è stato sviluppato da V.L. Mainardi {6}. A causa di vincoli geometrici, è stata scelta una geometria cilindrica per lo scaffold. Il modello CAD è stato ottimizzato per ottenere i risultati migliori in termini di stampabilità e mantenimento della forma (shape fidelity). In fine, la versione migliore per i parametri sopra citati è quella di Figura {Fig.0.2} caratterizzata da un diametro di 10 mm e un'altezza di 3 mm. Lo sviluppo della metodologia di colorazione era basato sulla necessità di avere una sostanza facilmente rimovibile, biocompatibile, che non influenzasse il processo di gelazione del bio-ink, con un buon coefficiente di attenuazione dei raggi X e che non compromettesse la vitalità cellulare. Considerando questi requisiti, l'unica strada percorribile era quella di colorare il mezzo di coltura. Dopo un'attenta analisi della letteratura, si è scelto di utilizzare il Dotarem come mezzo di contrasto. Il Dotarem è un mezzo di contrasto a base di Gadolineo, normalmente impiegato per Imaging di Risonanza Magnetica in pazienti umani. Gli scaffold sono stati stampati utilizzato una stampante 3D presente all'ETH di Zurigo, Svizzera (Laboratorio di Bone Biomechanics), utilizzando due bio-inks: AlgGel e 1GO. Successivamente gli scaffold sono stati posti nel bioreattore statico ed è stata aggiunta la soluzione, composta di mezzo di coltura e mezzo di contrasto (Dotarem) in diverse concentrazioni. In seguito, gli scaffold sono stati scansionati con la microCT e le ricostruzioni ottenute sono state utilizzate per acquisire i dettagli della struttura stampata e impiegate per effettuare le simulazioni CFD utilizzando COMSOL. Per poter valutare le proprietà meccaniche della geometria cilindrica, stampata con due inchiostri, sono stati condotti dei test meccanici di compressione uni-assiale con la macchina Zwick. La macchina ha registrato i dati forza-spostamento, che sono stati convertiti in curve sforzo-deformazione, dalle quali è stato estrapolato il valore del modulo elastico. La vitalità cellulare è stata studiata utilizzando una colorazione fluorescente a base di Calceina e Ethidium Homodimer {7}. La morfologia cellulare e la densità cellulare sono state esaminate con valutazioni istologiche e immunoistochimiche, utilizzando colorazioni specifiche, rispettivamente Ematossilina Eosina, Sirius Red e Alizarin Red per l'istologia e Osteocalcina e Sclerostina per l'immunoistochimica {8, 9}. {Risultati e Discussione} Sono state testate diverse concentrazioni di Dotarem per la metodologia di colorazione, ma hanno tutte portato allo stesso risultato, come mostra la Figura {Fig. 0.3}. Il mezzo di contrasto diffonde velocemente nel materiale dello scaffold nel tempo richiesto per effettuare una scansione (45 minuti). Dotarem non ha dato i risultati sperati, perciò si è scelto di cambiare approccio. Inizialmente si è effettuata una scansione senza soluzione (senza mezzo di coltura e senza Dotarem), dalla quale si è potuto constatare che il mezzo di coltura e lo scaffold hanno un coefficiente di attenuazione dei raggi X simile e per poter apprezzare i dettagli della struttura dello scaffold è necessario rimuovere il mezzo di coltura. Per questo motivo, è stata effettuata una scansione dello scaffold "asciugato", ovvero abbiamo posizionato delle salviette Kimetech sulla parte superiore e inferiore dello scaffold per assorbire il mezzo di coltura in eccesso. Il risultato della scansione "a secco" è mostrata in Figura {Fig. 0.4} e mostra un livello di dettaglio della struttura molto maggiore rispetto alle scansioni effettuate in presenza di Dotarem. Le ricostruzioni microCT ottenute con il metodo "a secco" sono riportate in Figure {Fig. 0.5} e {Fig. 0.6} rispettivamente per AlgGel e 1GO. In Figura {Fig. 0.5} e {Fig. 0.6} sono rappresentate strutture con pori visibili e puliti. Per quantificare la corrispondenza fra il mdoello CAD e la struttura stampata, sono stati analizzati alcuni parametri geometrici come il diametro del filamento, l'area dello scaffold e la dimensione del poro, a partire da immagini ottenute con lo stereomicroscopio, subito dopo la stampa. V.L. Mainardi ha eseguito le simulazioni CFD sul modello CAD dello scaffold, invece in questo studio abbiamo effettuato le stesse simulazioni sulle strutture reali e confrontato i risultati ottenuti in {6} con i nostri, valutando la capacità del modello di predire i risultati in termini di pressione omeostatica, velocità del fluido e sforzi di taglio per due portate 0.7 ml/min and 7 ml/min utilizzando l'esperimento condotto sul bioreattore statico come controllo. I risultati più significativi sono illustrati in Tabella {Tab.0.1}. In Tabella {Tab.0.1} sono raggruppati i risultati per la portata 7 ml/min. Per tutti i parametri analizzati, il modello è stato in grado di predire in modo abbastanza accurato i risultati, tuttavia alcune differenze fra la previsione del modello e il risultato reale possono essere individuate. Ad esempio, se si considera la pressione omeostatica, sono visibili differenze nel valore di pressione sulla parte superiore dello scaffold fra la struttura di AlgGel e quella di 1GO ({Tab.0.1} B-C) a causa di dissimilarità nella stampa dei due scaffolds. Il flusso incontra più resistenza quando attraversa la struttura di AlgGel, a causa dei pori più piccoli rispetto a quelli della struttura 1GO. I risultati della velocità del fluido evidenziano una diversa distribuzione delle linee di flusso fra il modello e le strutture reali, imputabile alla maggiore irregolarità della struttura reale rispetto al modello. In fine, considerando i risultati degli sforzi di taglio, le strutture reali evidenziano i punti più critici nella parte più interna dello scaffold. I test meccanici confermano la maggiore rigidezza dello scaffold in 1GO rispetto alla struttura AlgGel. Il modulo elastico a compressione, calcolato come la pendenza del tratto lineare della curva sforzo-deformazione fra il 5% e il 15 % di deformazione, sottoposta a interpolazione lineare è rispettivamente di 1.8 kPa per lo scaffold in AlgGel e di 3 kPa per lo scaffold in 1GO. Le Figure {Fig.0.7} e {Fig.0.8} rappresentano i grafici sforzo-deformazione per i quattro campioni analizzati per ogni materiale. Dall'osservazione della parte plastica della curva, è possibile evincere una dispersione dei dati, imputabile, probabilmente, a un processo di stampa non molto riproducibile. Le simulazioni CFD sottolineano differenze in vari parametri fra la parte superiore e inferiore degli scaffolds, perciò è stata condotta un'analisi differenziata anche da un punto di vista istologico e immunoistochimico fra parte superiore e parte inferiore degli scaffolds. La Tabella {Table 0.2} contiene informazioni complementari riguardo le sezioni della parte superiore degli scaffold al giorno 42 di coltura. Troviamo le sezioni di istologia che danno informazioni riguardo alla compenenete hydrogel dello scaffold e le scansioni microCT forniscono informazioni relative alla parte mineralizzata dello scaffold. La metodologia di colorazione sviluppata in questo progetto, potrebbe fornire entrambe le informazioni sopra citate con un'unica analisi. Dal confronto delle due portate (0.7 ml/min e 7 ml/min) con il gruppo di controllo (statico) è evidente che all'aumentare della portata, aumenta anche la formazione di parte minerale. L'analisi immunoistochimica è stata condotta per esaminare lo stadio di crescita cellulare dopo 6 settimane di coltura a perfusione, utilizzando l'espressione di due proteine: Osteocalcina e Sclerostina. La prima è espressa dagli osteoblasti e la seconda dagli osteociti maturi. La Tabella {Table 0.3} mostra le sezioni inferiori dei campioni sottoposti a 6 settimane di coltura a perfusione. Il segnale della colorazione con Osteocalcina è presente, indicando presenza di osteoblasti, quello della Sclerostina è, invece, assente, ciò potrebbe essere spiegato da un periodo di coltura insufficiente per far sviluppare completamente gli osteociti. Il gruppo 7 ml/min evidenzia un cambio nella forma delle cellule: si può notare la presenza di strutture allungate, tipiche degli osteociti, indicando, probabilmente, una iniziale trasformazione da osteoblasti in osteociti. {Conclusioni e prospettive future} In questo studio abbiamo sviluppato una metodologia di colorazione, che è stata applicata a degli scaffold acellulari, perciò consideriamo opportuno condurre uno studio analogo su scaffold seminati con cellule per valutare la vitalità cellulare. Le simulazioni CFD condotte sulla struttura reale, riportano risultati simili rispetto a quelli ottenuti dalle simulazioni sul modello CAD, evidenziando la correttezza delle ipotesi del modello usato in COMSOL. In generale, noi poniamo molta attenzione sul potenziale della struttura reale, che può tenere traccia dell'effetto del tempo, indicando potenziali cambiamenti dell'hydrogel dal giorno 0 fino alla fine del processo di mineralizzazione. Inoltre, l'utilizzo della struttura reale permette di effettuare una valutazione simultanea del processo di mineralizzazione e della fluidodinamica. Dagli studi sulla vitalità cellulare e i test meccanici, emerge che la struttura cilindrica, che siamo stati costretti ad utilizzare a causa di vincoli geometrici, è una valida alternativa rispetto alle soluzioni già esistenti. In fine, per essere in grado di osservare l'espressione della Sclerostina nei saggi di Immunoistochimica, sarebbe necessario testare una coltivazione più lunga in termini temporali. In una prospettiva futura, noi consigliamo di eseguire un esperimento di perfusione anche sugli scaffold stampati in 1GO per un periodo più lungo di 6 settimane, idealmente compreso fra le 8 e le 10 settimane.