From batch chromatography to MCSGP : experimental and modeling approaches combined to optimize yield and productivity in the purification of a model PEGylated protein

Since 1980s, therapeutic proteins have gained attention in the pharmaceutical field due to their highly specific activity and reduced side effects if compared to chemical drugs. The increasing interest in therapeutic proteins has led the current evolution of the design of the proteins, making them more stable and safer, and the improvement of of the upstream step of their manufacturing process. However, the same development observed in the design and upstream step of therapeutic proteins is not seen in the purification step. Indeed, batch chromatography is still the most popular technique of choice for purification of therapeutic proteins, but it is often limited in terms of yield-purity trade-off, especially for separation of samples containing a large number of product-related impurities. This limiting trade-off can be overcome by using multicolumn continuous chromatography such as Multicolumn Countercurrent Solvent Gradient Purification (MCSGP) which combines the advantages of batch chromatography such as the capability to perform linear elution gradients, and the ones of continuous countercurrent chromatography, such as the high recovery of the main product from the impurities keeping at the same time high purity of the collected sample. During this work, MCSGP was implemented from design batch chromatography of a model therapeutic protein (PEGylated lysozyme) to test the capability of MCSGP to overcome the intrinsic yield-purity trade-off of batch chromatography. In line with the intention of developing the purification process of therapeutic proteins, a mechanistic model was used to simulate batch chromatography. The aim of the model implementation was to reduce the time, costs and experimental efforts of the process parameters optimization step which is the search for a favourable and robust operating point of the separation process. From comparison of MCSGP to the batch chromatography, MCSGP showed its advantages in increasing not only the yield of the main product but also the productivity of the separation process. Moreover, the simulations of batch chromatography using the mechanistic model showed a good approximation of the batch chromatography for low and medium concentration loading conditions but not the maximum loading condition. In addition, the trend of the yield with respect to increasing loading condition is not described by this mechanistic model since the shape of the elution peaks of the product and the impurities did not change with the increasing loading condition. Therefore, there is the need of implementation of an empirical relation which can correlate the shape of the peaks with the loading conditions.

Dagli anni ’80, le proteine terapeutiche si sono distinte nella ricerca dell’industria farmaceutica grazie alla loro particolare specificità nei confronti delle cellule bersaglio e alla minore incidenza di effetti collaterali, differenziandole dai farmaci comuni. Questi e altri vantaggi legati all’utilizzo di proteine terapeutiche hanno incentivato il corrente sviluppo della loro progettazione, rendendole sempre più sicure, funzionali e stabili, e del loro processo di produzione. Tuttavia, lo stesso progresso non si è osservato nel processo di purificazione delle proteine terapeutiche che viene tutt’oggi svolto con una serie di cromatografie ortogonali in batch. La cromatografia in batch, soprattutto durante il processo di separazione della proteina terapeutica dalle impurità legate al prodotto, è limitata da relazione tra purezza del campione recuperato dal processo di separazione e recupero del quantitativo di proteina terapeutica dalla miscela. Di conseguenza, questa relazione non permette contemporaneamente di ottenere, a valle del processo di purificazione, un prodotto ad elevata purezza, richiesta dalle case farmaceutiche per motivi di sicurezza, e un recupero elevato della proteina terapeutica, la quale risulta essere costosa e difficile da realizzare in grandi quantità. Per risolvere questo problema, in questi anni si stanno sviluppando dei processi di cromatografia controcorrente continui, tra i quali possiamo individuare il processo Multicolumn Countercurrent Solvent Gradient Purification (MCSGP). Quest’ultimo ha la peculiarità di unire i vantaggi della cromatografia in batch, come l’imposizione di un gradiente di concentrazione del modifier, e della cromatografia controcorrente continua come il recupero di un elevato quantitativo di proteina terapeutica dalle impurità mantenendo un livello di purezza del campione recuperato elevata. Durante questo lavoro di ricerca, si è implementato l’MCSGP in un processo di purificazione di una proteina modello, lisozima PEGilato, e si sono comparati i risultati ottenuti da una tecnica di separazione di tipo batch con quelli dell’MCSGP in termini di purezza del campione recuperato, resa e produttività del processo di purificazione. In linea con l’intenzione di sviluppare il processo di separazione delle proteine terapeutiche, si è modellizzata la cromatografia in batch tramite l’utilizzato di un modello computazionale con lo scopo di ridurre i costi, i tempi e il numero di esperimenti necessari per la ricerca dei parametri di processo ottimi per il processo di separazione della proteina. Dall’implementazione sperimentale è emerso che l’MCSGP è stato in grado di recuperare un elevato quantitativo di proteina terapeutica, mantenendo una purezza del campione elevata e migliorando la produttività del processo di separazione. Per quanto riguarda i risultati delle simulazioni è emerso che il modello è stato in grado di approssimare la cromatografia in batch con iniezioni nella colonna di campione a concentrazione diluita e intermedia, ma non quelle relative all’iniezione di elevate concentrazioni di campione. Inoltre, la variazione della resa del processo al variare della concentrazione del campione iniettato nella colonna non viene descritta da questo modello poiché non contiene un’equazione empirica che metta in relazione la concentrazione del campione iniettato nella colonna con la forma dei picchi di eluizione. Di conseguenza, sarà necessario implementare questa equazione per completare il modello.