Sviluppo e caratterizzazione di nanoparticelle polimeriche per il trattamento della risposta infiammatoria glia-mediata dopo lesione al midollo spinale

Traumatic spinal cord injury indicates permanent or temporary damage to the spinal cord (SC), with significant socioeconomic implications for patients and caregivers. The global incidence is 10.5 cases per 100,000 people, or 768,473 new cases per year worldwide, mainly due to road accidents, accidental falls, sports, weapons and accidents at work (Kumar, R. et al. 2018). The clinical outcomes of this neurological condition depend on the severity and location of the lesion, resulting in an alteration of the sensory and / or motor function below the damaged site. Thoracic injuries can cause paraplegia, whereas cervical injuries are associated with quadriplegia. To date, the most effective clinical procedure to limit tissue damage is an early surgical decompression (<24 hours after injury) of the SC and only one drug (methylprednisolone) is FDA and EMA approved, but its effect is controversial (Fehlings & Baptiste, 2005). Spinal cord injury (SCI) commonly results from a sudden impact on the spine that fractures or dislocates the vertebra. This event is known as a primary lesion and its extent determines the severity and outcome of SCI. This event, from pathophysiological point of view is characterized for a primary lesion and its extent determines the severity and outcome of SCI. The primary injury involves damage to the ascending and descending pathways of the SC, disruption of blood vessels, rupture of cell membranes, systemic hypotension and ischemia. Within minutes of the primary injury, secondary injury begins and continues for weeks to months, causing progressive damage to the SC tissue surrounding the injury site. The acute phase of secondary injury includes ion imbalance, accumulation of neurotransmitters, free radical formation, calcium influx, lipid peroxidation, inflammation, edema, and cell necrosis. The lesion then evolves into the subacute phase involving apoptosis, demyelination of the surviving axons, Wallerian degeneration and the formation of a glial scar around the lesion site. Further changes occur in the chronic phase of the injury, including the formation of a cystic cavity, progressive axonal death, and complete growth of the glial scar (Oyinbo CA, 2011; Michael Fehlings AR et al. 2013; Leden RE et al. 2017; Tran AP et al. 2017; Alizadeh A et al. 2015). The serious complexity of the pathophysiology of SCI is due to the different biochemical and physiological changes that occur in the damaged spinal cord. In the past few decades, researchers have made significant efforts to unravel the cellular and molecular mechanisms underlying tissue degeneration and repair in damaged SC. Among them, the astrocyte response and their inflammatory contribution after SCI were deeply investigated and considered key players in the progression of the lesion (Anderson et al. 2014; Faulkner et al. 2004). Indeed, astrocytes play a fundamental role in the neuroinflammatory processes of spinal injuries. Following SCI, they become reactive and undergo a spectrum of changes in their phenotype, gene expression and proliferation. This activation phenomenon is known as "reactive astrogliosis". Astrogliosis is a very dynamic cellular response during the progression of SCI, which can have beneficial or detrimental effects on the recovery of motor function after SCI. Astrogliosis also affects the extracellular environment which in turn greatly influences the intrinsic ability of the axon to regenerate. It is known that during damage many molecules show inhibitory effects for the regeneration of axons and among them there are also the proteoglycans produced by astrocytes. Different neuropathological stimuli can induce different phenotypes of reactive astrocytes, respectively called oversimplified “A1” and “A2”. Astrocytes with phenotype A1 exert neurotoxic effects, upregulating many genes associated with neuronal degeneration, suggesting that A1 has a damaging "pro-inflammatory" action. Conversely, astrocytes with the A2 phenotype exert protective effects by inducing the expression of neurotrophic factors that promote neuronal survival and regrowth. Therefore, it is important to develop strategies to modulate reactive astrocytes and their deleterious effects, to promote a protective environment after SCI (Liddelow & Barres, 2017; Gaudet & Fonken., 2018; Liddelow, et al., 2017). In order to neutralize only the negative effects of astrogliosis, different approaches have been employed, such as gene manipulation and drug / biological therapies (Smith, et al., 2018; Bradbury, et al., 2002; Lang, et al. , 2015; Siebert, Steencken, & Osterhout, 2014, Gorshkov, Aguisanda, Thorne, & Zheng, 2018). However, these techniques show some limitations: they are not selective for astrocytes, or they have ethical implications related to the use of genetic engineering. The challenge of recent years is, therefore, to formulate a therapeutic strategy that maximizes the effectiveness of the treatment in astrocytes overcoming the above mentioned limitations. In this regard, bioengineering has made it possible to develop new therapeutic strategies based on nanovectors or nanoparticles (NPs). Thanks to their versatility in terms of size, surface and hydrophilic or lipophilic characteristics, NPs offer significant advantages in the ability to target individual cells or subcellular structures and to maintain drug levels in a desired range (Vismara, 2017; Papa, Caron, Rossi, & Veglianese, 2016; Caron, Papa, Rossi, Forloni, & Veglianese, 2014; Rossi, Perale, Papa, Forloni, & Veglianese, 2013; Perale, et al., 2011). A large number of nanovectors have been tested in SCI preclinical models (Papa et al. 2019), but few attempts have been made to selectively target astrocytes (Gao & Borgens, 2015; Li, et al. 2016; Smith, et al. 2018). In this thesis work, held at Istituto Di Ricerche Farmacologiche “Mario Negri” - unità ‘Trauma Spinale Acuto e Neurorigenerazione’, we focused on a specific category of NP, commonly referred to as nanogel (NG). Their advantages, compared to other NPs, lie in greater colloidal stability, due to an increased affinity for water, together with a longer retention of their load and an easy and reproducible synthesis. The NG can move towards different subcellular compartments and, once internalized, show a tailored capacity to delivery in the presence of redox reactions, enzymatic reactions and pH changes. Specifically, in this study the selectivity of specific NG was characterized both in vitro and in vivo paradigms. NG composed of polyethylene glycol (PEG) and polyethyleneimine (PEI) polymers were functionalized with different molecules, in order to make it selective for astrocytes and at the same time limiting its absorption by the microglial / macrophages. Four main functionalizations were investigated, obtained from the combination of three chemical groups conjugated to NG: functionalization with bromo-propylamine allowed obtaining a coating of primary amines on the surface of the NG; the other two fractions consist of Rhodamine B (RhB) or Cyanine 5 (Cy5) chromophores, added to visualize NGs in in vitro or in vivo experiments. We studied selectivity and cellular uptake in primary spinal cord co-cultures. We demonstrated that NG functionalized with both groups -NH2 and -Cy5 were selectively internalized in astrocytes, whereas limited internalization was found in macrophages, and no internalization was found in neuronal cells. Subsequently, in order to verify the distribution of NG in vivo, NGs were injected into the injured spinal cord of C57BL / 6J mice. Noteworthy, the fluorescence signal of -NH2 -Cy5 NG was found diffuse in the epicenter of the lesion and around the lesion site, and again co-localized almost exclusively in astrocytes; whereas other NGs evaluated did not show selectivity for astrocytes, but were also found in microglia/macrophages. This validates the previous results in vitro and pave the way for a selective drug treatment of the astrocytic pro-inflammatory response after SCI, and potentially other neurodegenerative disease can benefit from it.

La lesione traumatica del midollo spinale indica un danno, permanente o temporaneo, del midollo spinale (MS), con notevoli implicazioni socioeconomiche per i pazienti e per coloro che li assistono. L’incidenza globale è di 10,5 casi per 100.000 persone, dovuti principalmente a incidenti stradali, cadute accidentali, sport, armi ed incidenti sul lavoro (Kumar, R. et al. 2018). La lesione al midollo spinale (LMS) deriva comunemente da un impatto improvviso sulla colonna vertebrale che frattura o lussa la vertebra. Questo evento è noto come lesione primaria e la sua entità determina la gravità e l'esito della LM. La lesione primaria comporta il danneggiamento delle vie ascendenti e discendenti del MS, l’interruzione dei vasi sanguigni, la rottura delle membrane cellulari, ipotensione sistemica e ischemia. Entro pochi minuti dalla lesione primaria inizia quella secondaria e continua per settimane o mesi, causando un danno progressivo del tessuto del MS che circonda il sito del danno. La fase acuta della lesione secondaria comprende squilibrio ionico, accumulo di neurotrasmettitori, formazione di radicali liberi, afflusso di calcio, perossidazione lipidica, infiammazione, edema e necrosi cellullare. La lesione evolve, poi, nella fase subacuta che coinvolge l'apoptosi, la demielinizzazione degli assoni sopravvissuti, la degenerazione walleriana e la formazione di una cicatrice gliale attorno al sito della lesione. Ulteriori cambiamenti si verificano nella fase cronica della lesione, inclusa la formazione di una cavità cistica, la morte progressiva assonale e la completa formazione della cicatrice gliale (Oyinbo CA, 2011; Michael Fehlings AR et al. 2013; Leden RE et al. 2017; Tran AP et al. 2017; Alizadeh A et al. 2015). Si desume la grave complessità della fisiopatologia della LMS dovuta ai diversi cambiamenti biochimici e fisiologici che si verificano nel midollo spinale danneggiato. Negli ultimi decenni, numerose evidenze indicano che l'infiammazione acuta gioca un ruolo chiave nella LMS e porta con sé conseguenze sistemiche e locali, contribuendo alla progressione della lesione con conseguente sviluppo di tessuto cicatriziale e inibizione dei processi rigenerativi assonali. Molte cellule sono coinvolte nella risposta infiammatoria in seguito alla lesione, tra cui microglia, macrofagi e astrociti. In caso di lesione, i macrofagi popolano l'epicentro della lesione, mentre la microglia residente si trova principalmente nell'area perilesionale. Sulla base dei segnali microambientali, queste cellule possono essere polarizzate verso il fenotipo pro-infiammatorio (M1) o anti-infiammatorio pro-rigenerativo (M2) e di conseguenza contribuiscono ai processi di lesione o riparazione a seguito della LMS. Le cellule M1 sono neurotossiche e sono responsabili del danno tissutale dopo la LMS, impedendo la rigenerazione neuronale. Le cellule M2, invece, promuovono medinate il rilascio di fattori trofici la ricrescita assonale, la rimielinizzazione e la rigenerazione neuronale. Inoltre, è stato dimostrato che vi è una della prevalenza del fenotipo M1 nel sito del danno: la risposta di tipo M2, infatti, è di minore entità e si manifesta solo temporaneamente. Anche gli astrociti svolgono un ruolo fondamentale nei processi neuroinfiammatori delle lesioni spinali. In seguito a LMS, essi, infatti, diventano reattivi e possono assumere diversi fenotipi caratterizzati per una diversa espressione genica. Questo fenomeno di attivazione è noto come “astrogliosi reattiva” ed è una risposta cellulare molto dinamica durante la progressione della LMS, in grado di avere effetti benefici o dannosi sul recupero della funzionalità motoria. Stimoli neuropatologici differenti sono in grado di indurre due diversi fenotipi di astrociti reattivi, rispettivamente denominati “A1” e “A2”. Gli astrociti con fenotipo A1 esercitano effetti neurotossici, suggerendo che A1 abbia un'azione dannosa. Al contrario, gli astrociti con fenotipo A2 esercitano effetti protettivi inducendo l'espressione di fattori neurotrofici che promuovono la sopravvivenza e la ricrescita neuronale. (Liddelow & Barres, 2017; Gaudet & Fonken., 2018; Liddelow, et al., 2017). Altri studi hanno poi dimostrato che la risposta astrocitaria è fondamentale nel limitare il danno secondario dimostrando che la lesione rimane più circoscritta nella zona di danno primario quando la componente astrocitaria è in grado di migrare intorno al sito di danno, invece che dopo un blocco della migrazione attraverso manipolazione genetica (Anderson, et al., 2016). Al fine di neutralizzare solo gli effetti negativi dell’astrogliosi, sono stati impiegati diversi approcci, come la manipolazione genica e le terapie farmacologiche / biologiche (Smith, et al., 2018; Bradbury, et al., 2002; Lang, et al., 2015; Siebert, Steencken, & Osterhout, 2014, Gorshkov, Aguisanda, Thorne, & Zheng, 2018). Tuttavia, queste tecniche mostrano alcune limitazioni: - trattamenti farmacologici non riescono ad essere selettivi per la sola componente astrocitaria ed importanti effetti collaterali possono presentarsi limitando la capacità terapeutica - le terapie geniche presentano ancora diversi problemi etici e ad ora non risultano essere una valida alternativa clinica al momento. La sfida degli ultimi anni è, quindi, quella di formulare una strategia terapeutica che massimizzi l’efficacia del trattamento riducendone gli effetti collaterali. A tal proposito, la bioingegneria ha permesso di sviluppare nuove strategie terapeutiche basate su nanovettori o nanoparticelle (NPs), che grazie alla loro versatilità in termini di dimensioni, superficie e caratteristiche idrofile o lipofile, offrono notevoli vantaggi nella capacità di indirizzare il trattamento verso singole cellule o strutture subcellulari, e di rilasciare livelli del farmaco in modo controllato (Vismara, 2017; Papa, Caron, Rossi, & Veglianese, 2016; Caron, Papa, Rossi, Forloni, & Veglianese, 2014; Rossi, Perale, Papa, Forloni, & Veglianese, 2013; Perale, et al., 2011). Un gran numero di sistemi nanoparticellari sono stati testati in modelli di LMS (Papa et al. 2019), ma pochi risultano essere i tentativi fatti per trattare la componente astrocitaria del sistema nervoso centrale (Gao & Borgens, 2015; Li, et al. 2016; Smith, et al. 2018). In questo lavoro di tesi, svolto presso l’Istituto di Ricerche Farmacologiche “Mario Negri IRCCS” - unità ‘Trauma Spinale Acuto e Neurorigenerazione’, ci siamo concentrati su una specifica categoria di NPs, comunemente indicate come nanogel (NG) che può dirigersi verso diversi compartimenti subcellulari e, una volta internalizzato, mostra un’abile capacità di rilascio del composto sotto diversi stimoli; reazioni redox, reazioni enzimatiche e variazioni del pH. Nello specifico, nel nostro studio è stata caratterizzata la selettività di un NG verso la componente astrocitaria del midollo spinale sia in vitro che in vivo. Il NG testato è composto dai polimeri polietilenglicole (PEG) e polietilenimmina (PEI) ed è stato funzionalizzato con diverse molecole, al fine di renderlo selettivo per gli astrociti e limitandone contemporaneamente l'assorbimento da parte della popolazione microgliale / macrofagica. Infatti, microglia/macrofagi sono le prime cellule in grado di captare le NPs, considerati materiali estranei (Gustafson, Holt-Casper, Grainger, & Problem., 2015), per poi degradarli nei lisosomi (Gustafson, Holt-Casper, Grainger, & Problem., 2015). Da qui nasce la necessità di progettare NPs più selettive per gli astrociti e meno riconoscibili dal sistema immunitario. A questo scopo, è stata indagata una funzionalizzazione, ottenuta mediante coniugazione di bromo-propilammina su NG che ha permesso di ottenere un coating di ammine primarie sulla superficie del NG. È stata scelta questa funzionalizzazione perché da valutazioni precedenti nel nostro laboratorio, NPs con gruppi amminici mostravano una ridotta internalizzazione nella componente microgliale/macrofagica. Mentre Rodamina B (RhB) o Cianina 5 (Cy5) sono state coniugate per seguire i NG in esperimenti in vitro e in vivo. Dalle analisi effettuate è stata dimostrata la maggiore selettività nei confronti degli astrociti in presenza di NG funzionalizzato con entrambi i gruppi -NH2 e -Cy5. Mentre un’internalizzazione limitata è stata dimostrata da parte di microglia e macrofagi, e nessuna internalizzazione da parte dei neuroni. Successivamente abbiamo validato in vivo i NG caratterizzati in vitro, iniettandoli nel midollo spinale di topi spinalizzati, in modo da verificare la distribuzione e l’internalizzazione cellulare. Il segnale del NG, funzionalizzato con il coating -NH2 -Cy5, è stato individuato in maniera selettiva e co-localizzata quasi esclusivamente negli astrociti. Alcune cellule microgliali e neuroni sono risultati positivi ai NG, ma solo nell'epicentro della lesione, ipotizzando l'alterata integrità della membrana di tali cellule nei pressi della zona lesionata. Infine, mediante analisi ex-vivo, sono state valutate l’astrocitosi e la perdita neuronale dimostrando una ridotta degenerazione secondaria dopo il danno primario. Questo studio ha posto le basi per un trattamento mirato della risposta pro-infiammatoria astrocitaria per un potenziale recupero funzionale in pazienti con LMS. Inoltre, questo approccio apre le porte a studi successivi di drug delivery, anche in altri contesti terapeutici, come ad esempio nel caso malattie neurologiche o patologie che abbiano una componente infiammatoria mediata da astrociti.