Setting up of a neuroblastoma cell invasion dynamic 3D model inside a millifluidic optically accessible biorector

Neuroblastoma is a pediatric tumor that originates from neural crest cells (NCCs), characterized by a high heterogeneity that affects the clinical conditions of patients. LIN28B, an important gene in embryonic development, has a key role in the formation and progression of several diseases when not physiologically expressed. Indeed, an overexpression of LIN28B leads to an impaired differentiation of sympathoadrenal precursors leading to neuroblastoma genesis in addition to enhancing the cell migration and invasion. Among the new bioengineered devices that could overcome the limitations of the gold standard 2D culture for neuroblastoma tumor cells, we count the miniaturized optically accessible bioreactor (MOAB), able to replicate in vitro both 2D and 3D cultures provided with a constant flow of growth medium. In this study we investigated a suitable protocol for human neuroblastoma cancer cell line SH-SY5Y in MOAB, in 2D and 3D in nichoid to confirm in real-time the migratory and invasive phenotypes of SH-SY5YLIN28B overexpressing LIN28B. This work was supported by the Neuroblastoma laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza (Padua, Italy), supervised by Dott. Aveic Sanja and assisted by the neuroblastoma team (Dr. Corallo Diana and Miss Pantile Marcella). We focused on determine the most suitable number of cells to be plated, flow rate (respective shear stress) and amount of growth medium to be provided to cells, choice of dye for fluorescent live-cell analysis. Finally, after assessing the viability of cell cultures by LIVE/DEAD assay, we performed a Time Lapse imaging for migratory analysis. The results obtained in dynamic conditions statistically confirmed an increase of cell motility of neuroblastoma cells due to overexpression of LIN28B, both in terms of distance and speed. There was no significant difference between SH-SY5YLIN28B cells cultured in 2D and 3D in nichoid, even though different patterns of migration were observed. Hence, further investigations will lead in future to a better understanding of 3D structures in dynamic conditions, permitting to exploit all its potentiality as disease model.

Il neuroblastoma è una forma tumorale pediatrica che origina da cellule della cresta neurale (NCCs), caratterizzato da un’elevata eterogeneità che influenza le condizioni cliniche dei pazienti. LIN28B, un gene importante per lo sviluppo embrionale, ha un ruolo chiave nella formazione e progressione di diverse tipologie tumorali quando non espresso fisiologicamente. Infatti, una overespressione di LIN28B blocca il differenziamento dei precursori simpatoadrenergici promuovendo in questo modo la formazione di neuroblastoma, oltre a favorire la migrazione e invasività cellulare. Tra i nuovi dispositivi di bioingegneria che potrebbero superare i limiti delle colture cellulari in 2D, il gold standard per lo studio in oncologia di neuroblastoma, si può annoverare il miniaturized optically accessible bioreactor (MOAB), un bioreattore capace di replicare in vitro entrambe le colture 2D e 3D mantenendo una condizione dinamica con un costante flusso di medium di crescita alle cellule. In questo studio abbiamo indagato le migliori condizioni per poter effettuare una coltura 2D e 3D in nichoid di linee cellulari umane di neuroblastoma SH-SY5Y all’interno del MOAB per confermare in tempo reale il fenotipo migratorio e invasivo delle cellule SH-SY5YLIN28B overesprimenti LIN28B in confronto alle cellule SH-SY5YCTRL di controllo. Questo lavoro è stato supportato dal laboratorio di Neuroblastoma, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza (Padova, Italia), supervisionato dalla Dott. Aveic Sanja e assistito dal team di Neuroblastoma (Dr. Corallo Diana e Sig.ra Pantile Marcella). Ci siamo concentrati sul determinare il numero di cellule più idoneo da seminare, un flusso (e rispettivi shear stress) adeguato a fornire il giusto quantitativo di medium di crescita alle cellule, un colorante ideale per l’analisi live-cell in fluorescenza. Infine, dopo aver confermato la sopravvivenza cellulare in coltura con un’analisi LIVE/DEAD, abbiamo acquisito delle immagini in Time Lapse per lo studio della migrazione cellulare. I risultati ottenuti in condizione dinamica hanno confermato un aumento significativo della motilità cellulare di neuroblastoma dovuta a una overespressione di LIN28B, sia in termini di distanza che di velocità. Non sono state riscontrate invece delle differenze significative tra i dati raccolti dalle culture dinamiche 2D e 3D in nichoid, nonostante siano stati evidenziati dei pattern di migrazioni diversi. Si sottolinea quindi la necessità in futuro di effettuare ulteriori valutazioni per poter comprendere e sfruttare al massimo le potenzialità della coltura tridimensionale in una condizione dinamica, fornendo così un modello tumorale per lo studio di neuroblastoma.