Challenge against drug induced liver Injury : decellularized ECM based hydrogel for micro-physiological system

The liver is the largest organ of the human body, with hundreds of functions to satisfy and with a crucial role in drug metabolism. For this reason, the liver is a major player in the contest of drug development, and assessing the absence of hepatotoxic effects represents a priority when developing a new active principle. The availability of a trusty and effective platform to investigate in vitro drug-induced hepatotoxicity would thus represent a turning point for drug development processes. Actually, it would allow not only to drastically reduce animal experimentation but also to speed up the entire pipeline. Recently, thanks to the development of new processing techniques, it has been possible to witness a paradigm shift, from the classical 2D cell cultures to 3D, cellularized constructs. These cellularized organoids allow to reproduce more adherently the structural properties of the physiological environment, and thus to observe cellular behavior which is much more similar to the one observable in vivo if compared to 2D cultures. Natural polymers are the main actors in the realization of these structures, due to their tailorable crosslinking dynamics, joint with the absence of cytotoxic effects. In light of this, this work will present the first steps of the development of alginate and ECM-based, in vitro 3D model of this organ which will be able to support the survival and the growth of the hepatocytes to assess drugs hepatotoxicity. After decellularization, the liver extracellular matrix (ECM) was freeze-dried, reduced into a fine powder, and used as a basic component for cells-embedding alginate hydrogels. They were characterized in terms of stability through time and solid vs. liquid content. Subsequently, rheological properties of the hydrogel were characterized and compared to the ones of physiological liver tissue. The second phase of this work included the realization of cell-loaded gels, for which HepG2 cell suspension was added to the gel-precursor solution to obtain the proper concentration (almost 2.5 x 106 cells/mL). Then the hydrogels were submerged in a medium after their cross-linking and incubated in culture condition. The viability of the cells within the gels was evaluated qualitatively (confocal microscopy) and quantitatively (MTT assay) after various time points. The ECM-based hydrogel meets the mechanical characteristic of the natural tissue, and increased hepatocytes viability through a protein content similar to the one of the native liver and a very low residual and immunogenic nucleic acid content. Furthermore, it maintains these features for a necessary period to perform hepatotoxicity tests. The in vitro liver model produced in this work can be tailored by tuning the composition and the cross-linking. The introduction of ECM from natural source allows to have an in vitro model where cells interact producing aggregates typical of the physiological tissue. This model can be employed for toxicology and preclinical drug evaluation.

Il fegato è il più grande organo del corpo umano, con centinaia di funzioni da soddisfare e con un ruolo cruciale nel metabolismo dei farmaci. Per tale ragione, il fegato ha un ruolo importante nel contesto dello sviluppo di farmaci e nella valutazione di assenza di effetti epatotossici rappresentando una priorità nello sviluppo di un nuovo principio attivo. La disponibilità di un substrato affidabile ed efficace per studiare in vitro l'epatotossicità indotta da farmaci in vitro potrebbe dunque rappresentare un punto di svolta per i processi di sviluppo dei farmaci. In realtà, consentirebbe non solo di ridurre drasticamente la sperimentazione sugli animali, ma anche di accelerare l'intera pipeline. Recentemente, grazie allo sviluppo di nuove tecniche di elaborazione, è stato possibile assistere ad un cambiamento radicale, dalle classiche colture cellulari 2D, ai costrutti 3D, cellularizzati. Questi organoidi cellularizzati consentono di riprodurre in modo più aderente le proprietà strutturali dell'ambiente fisiologico e, quindi, di mantenere un comportamento cellulare molto più simile a quello osservabile in vivo, rispetto alle colture 2D. I polimeri naturali sono i principali attori nella realizzazione di queste strutture, grazie alla loro dinamica di reticolazione personalizzabile, unita all'assenza di effetti citotossici. Alla luce di queste considerazioni, questo lavoro presenterà i primi passi dello sviluppo di un modello 3D in vitro di questo organo basato su alginato ed matrice extracellulare (ECM) che sarà in grado di supportare la sopravvivenza e la crescita degli epatociti per valutare l'epatotossicità dei farmaci. Dopo la decellularizzazione, l'ECM ottenuta da fegato è stata liofilizzata, ridotta in polvere fine e poi utilizzata come componente base per gli idrogel di alginato che incorporeranno le cellule scelte. Sono stati caratterizzati in termini di stabilità nel tempo e del contenuto solido rispetto a quello liquido. Successivamente sono state caratterizzate le proprietà reologiche dell'idrogelo stesso e confrontate con quelle del tessuto epatico fisiologico. La seconda fase di questo lavoro ha visto la realizzazione di gel nei quali sono state inserite le cellule, in particolare una sospensione cellulare HepG2 è stata aggiunta alla soluzione del precursore del gel per ottenere la giusta concentrazione (quasi 2,5 x 106 cellule per mL). Quindi gli idrogeli sono stati immersi nel mezzo dopo la loro reticolazione e incubati in condizioni di coltura. La vitalità delle cellule all'interno dei gel è stata valutata qualitativamente (mediante microscopia confocale) e quantitativamente (mediante saggio MTT) in vari istanti temporali. L’idrogelo a base di ECM prodotto soddisfa le caratteristiche meccaniche del tessuto naturale, permettendo di aumentare la vitalità degli epatociti mediante un contenuto proteico simile a quello del fegato nativo e un contenuto di acido nucleico residuo e, dunque, immunogenico molto basso. Inoltre, permette di mantenere queste caratteristiche per un periodo di tempo sufficiente ad eseguire i test di epatotossicità. Il modello in vitro di fegato che si è ottenuto in questo lavoro può essere personalizzato regolandone la composizione ed il grado di reticolazione. L’introduzione della matrice extracellulare ottenuta da fonte naturale ha permesso di realizzare un modello in vitro nel quale le cellule interagiscono producendo aggregati tipici del tessuto fisiologico. Tale modello può essere utilizzato per la valutazione tossicologica e preclinica dei farmaci.