In vitro modelling of the proprioceptive sensory circuit in a 3D compartmentalized microfluidic device

Proprioception refers to the sense of tension or position and movement of limbs. Muscle spindles are considered as the main proprioceptors [1], whose function is to communicate muscle length variations to the brain [2]. When spindles feel muscle stretch, the information is processed through two different types of neurons: dorsal root ganglia (DRG) sensory neurons (afferent fibers), which generate an action potential, propagating towards central nervous system (CNS), and -motor neurons (efferent fibers), which generate an appropriate response to the stimulus [2]. Friedreich’s ataxia (FRDA) is the most common hereditary ataxia [3]. The first affected structures in FRDA degeneration are those of the proprioceptive circuit. In fact, patients’ DRGs appear smaller than normal, with atrophied, if not absent, primary sensory neurons [4] [5]. Nowadays, there are no treatments capable of either stopping or slowing down the pathological progression of the disease. For this reason, it is essential to develop accurate models to replicate FRDA, to study its mechanisms and to test new therapeutic approaches. Current developments of stem cell biology include the generation of 3D brain organoids, recapitulating brain development in vitro [6]. Combination of this technology with microfluidic devices can be a promising solution to reconstruct neuronal networks, as well as their connections with other cell types in an in vivo-like environment. However, the majority of the current microphysiological models of mechanosensory circuit, focused on the efferent part of the muscle innervation, rather than the afferent part, responsible for the communication from the periphery to the central nervous systems. Thus, a functional in vitro model of proprioceptive sensory circuit is still missing. The investigation of the mechanosensory complexity would need the design of functional in vitro models able to recapitulate the differentiation of both sensory neurons and intrafusal fibers (IFFs) [7]. Mazzara et al., for example, successfully generated in vitro organoids from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), recapitulating dorsal root ganglia (DRGO), and then reproduced the connection between sensory neurons and IFFs in 2D traditional cultures [8]. 2D traditional culture, however, does not allow localized investigation of the structures and of the degenerative mechanism of the FRDA disease. To address this aspect, a compartmentalized microfluidic device was previously developed by our research group to better mimic in vivo conditions [9]. The device consists of two separate compartments specific for the culture of DRGOs and for the 3D culture of muscle cells. The device is also equipped with an actuation layer, allowing the pressurization of the chamber to perform a confined compression of the muscle chamber. The technical characterization of the device was already performed [9], hence this thesis project focused on its biological validation. The assessment consisted in the development of a protocol for gel injection inside the device, followed by the evaluation of myoblasts arrangement in a 3D structure and their viability during both static and dynamic culture. Finally, the assessment was concluded with the optimization of DRGOs seeding and co-culture timeline, to recapitulate proper interactions between neurons and intrafusal fibers.

La propriocezione si riferisce al senso di posizione e movimento degli arti. I fusi muscolari sono considerati i principali propriocettori [1], la cui funzione è quella di comunicare al cervello le variazioni di lunghezza muscolare [2]. Quando i fusi sentono l'allungamento muscolare, l'informazione viene elaborata attraverso due diversi tipi di neuroni: neuroni sensoriali dei gangli della radice dorsale (DRG) (fibre afferenti), che generano un potenziale d'azione e lo trasmettono verso il sistema nervoso centrale (SNC), e i motoneuroni  (fibre efferenti), che generano una risposta adeguata allo stimolo [2]. L'atassia di Friedreich (FRDA) è l'atassia ereditaria più comune [3]. Le prime strutture interessate nella degenerazione FRDA sono quelle del circuito propriocettivo. Infatti, i DRG dei pazienti appaiono più piccoli del normale, con neuroni sensoriali primari atrofizzati, se non assenti [4] [5]. Al giorno d'oggi non esistono cure in grado di arrestare o rallentare la progressione patologica della malattia. Per questo motivo è essenziale sviluppare modelli accurati per replicare la FRDA, studiarne i meccanismi e testare nuovi approcci terapeutici. Gli attuali sviluppi della biologia delle cellule staminali includono la generazione di organoidi cerebrali 3D, in grado di ricapitolare lo sviluppo del cervello in vitro [6]. La combinazione di questa tecnologia con dispositivi microfluidici può essere una soluzione promettente per ricostruire le reti neuronali, nonché le loro connessioni con altri tipi di cellule in un ambiente simile a quello in vivo. Tuttavia, la maggior parte degli attuali modelli microfisiologici del circuito meccano-sensoriale, si è concentrata sulla parte efferente dell'innervazione muscolare, piuttosto che sulla parte afferente, responsabile della comunicazione dalla periferia al sistema nervoso centrale. Pertanto, manca ancora un modello funzionale in vitro del circuito sensoriale propriocettivo. Lo studia della complessità di questo sistema richiederebbe la progettazione di modelli funzionali in vitro in grado di ricapitolare la differenziazione sia dei neuroni sensoriali che delle fibre intrafusali (IFF) [7]. Mazzara et al., ad esempio, hanno generato con successo organoidi in vitro da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC), ricapitolando i gangli della radice dorsale (DRGO), e quindi riprodotto la connessione tra neuroni sensoriali e IFF in colture tradizionali 2D [8]. Questo tipo di colture, tuttavia, non consente indagini localizzate delle strutture e del meccanismo degenerativo della malattia FRDA. Per affrontare questo aspetto, un dispositivo microfluidico compartimentato è stato precedentemente sviluppato dal nostro gruppo di ricerca per imitare meglio le condizioni in vivo [9]. Il dispositivo è costituito da due compartimenti separati specifici per la coltura di DRGO e per la coltura 3D di cellule muscolari. Il dispositivo è inoltre dotato di uno strato di attuazione, che consente alla pressuriz-zazione della camera di eseguire una compressione confinata del costrutto muscolare. La caratterizzazione tecnica del dispositivo era già stata eseguita [9], quindi questo progetto di tesi si è concentrato sulla sua validazione biologica. La valutazione è consistita nello sviluppo di un protocollo per l'iniezione del gel all'interno del dispositivo, seguito dalla valutazione della disposizione dei mioblasti in una struttura 3D e della loro vitalità durante la coltura, sia statica che dinamica. Infine, la valutazione si è conclusa con l'ottimizzazione del seeding dei DRGO e della timeline di co-coltura, per ricapitolare le corrette interazioni tra neuroni e fibre intrafusali.