MWCNTs functionalized with D-aminoacid oxidase as novel nano-carrier in the cancer treatment : a proteomic approach through the promising strategy of oxidation therapy

In recent years, there has been an unprecedented expansion in the field of nanomedicine, with the development of new nanoparticles for the diagnosis and treatment of diseases such as cancer. Recently, several studies have been conducted in which multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs), cylindrical graphite structures, were used as drug delivery systems. In this research nanotubes were functionalized with polyethylene glycol (PEG) which is a polymer capable of increasing the biocompatibility of the nanostructure. Functionalization also controls the formation of the “protein corona”, a layer of physiological proteins adsorbed on the surface of nanoparticles, following their injection into the blood stream, whose characteristics can modulate the body's response, influencing its therapeutic effects. To obtain an adequate antitumor effect, PEG-MWCNTs have been functionalized with 'D-amino acid oxidase' (RgDAAO), a flavoenzyme capable of generating ROS (reactive oxygen species), specifically hydrogen peroxide (H2O2). H2O2 crosses cell membranes and causes oxidative damage to DNA, proteins and lipids, inducing apoptosis of cancer cells. The aim of this thesis project is to study the biocompatibility and anticancer effects of DAAO from Rhodotorula gracilis (RgDAAO) and its variant mDAAO, associated with functionalized MWCNTs, as delivery systems. mDAAO is variant form of the enzyme obtained with protein engineering approach which shows increased activity at low O2 concentrations. Enzymatic activity assays (to evaluate the ability to produce H2O2), incubations with human plasma (to investigate the composition of the corona protein) and cytotoxicity assays (to detect the therapeutic antitumor effect) were carried out.

Negli ultimi anni stiamo assistendo ad un'espansione senza precedenti delle ricerche nel campo della nanomedicina, con lo sviluppo di nuove nanoparticelle per la diagnosi e la cura di malattie come il cancro. Recentemente, in letteratura, sono stati condotti diversi studi in cui i nanotubi di carbonio a parete multipla (MWCNTs), strutture grafitiche di forma cilindrica, vengono utilizzati come sistemi per la somministrazione di farmaci. In questa ricerca i nanotubi sono stata funzionalizzati con polietilenglicole (PEG), un polimero in grado di aumentare la biocompatibilità della nanostruttura. La funzionalizzazione controlla anche la formazione del “protein corona”, uno strato di proteine fisiologiche adsorbite sulla superficie delle nanoparticelle, in seguito alla loro iniezione nel flusso ematico, le cui caratteristiche possono modulare la risposta dell’organismo, influenzando gli effetti terapeutici. Per ottenere un effetto antitumorale, i PEG-MWCNTs sono stati funzionalizzati con la ‘D-amminoacido ossidasi’ (RgDAAO), un flavoenzima in grado di generare ROS (specie reattive dell’ossigeno), nello specifico il perossido di idrogeno (H2O2). L’ H2O2 prodotta, attraversa le membrane cellulari e provoca danni ossidativi a DNA, proteine e lipidi, inducendo l'apoptosi delle cellule tumorali. Lo scopo di questo progetto di tesi è quello di studiare la biocompatibilità e gli effetti antitumorali della DAAO da Rhodotorula gracilis (RgDAAO) e della sua variante mDAAO, associate a MWCNTs funzionalizzati, impiegati come sistemi di somministrazione. La mDAAO è una variante enzimatica ottenuta con un approccio di ingegneria proteica che mostra una maggiore attività a basse concentrazioni di O2. Sono stati svolti saggi di attività enzimatica (per valutare la capacità di produrre H2O2), incubazioni con plasma umano (per investigare la composizione del protein corona) e studi di citotossicità (per valutare l’effetto terapeutico antitumorale).