Characterization of NF-kappaB dynamics in a model of tumor/microenvironment interaction using a combination of single-cell live imaging and microfluidics: insights from Multiple Myeloma

NF-κB is a family of transcription factors involved in cells survival, cytokines production and immune response. In physiological condition, NF-κB resides inactive in the cytoplasm; however, extracellular signals can activate NF-κB that translocates into the nucleus and promotes the transcription of several genes, including its own inhibitors, acting as negative feedback loops. Deregulation and hyperactivation of NF-κB pathway are one of the causes of the initiation and progression of the second most common haematological malignancy in Italy and US, Multiple Myeloma (MM). Frequent relapses and patient-specific drug resistance make MM still an incurable disease. In this PhD project we aimed at characterizing, for the first time, NF-κB dynamics in living MM and bone marrow (BM) stromal cells to better comprehend MM biology. A bioengineering approach with cutting-edge techniques, as quantitative single-cell live imaging and microfluidics was developed for this specific purpose. To exploit the advantages of live imaging at single cell resolution, the first efforts were dedicated to the endogenous tag of our protein of interest, p65, a subunit of the NF-κB family. By CRISPR/Cas9 technology, we succeeded in obtaining a p65 YFP (Yellow Fluorescent Protein) knock-in in two cells lines: MM.1S, as a paradigmatic MM tumoral cell line, and HS-5, representative for BM stromal cells. Upon validation of our cellular model, we quantified and described, with a custom-made MATLAB code, the dynamics of p65 in terms of Nuclear to Cytoplasmic Intensity (NCI), which is a magnitude dependent exclusively on the nuclear levels of p65, since we demonstrated that the total amount of p65 in our cells is constant. Both cells were subjected to static or continuous inflammatory stimulation provided by tumour necrosis factor alpha (TNF-α). Particular attention was dedicated to the dissection of how extrinsic factors from static setting (cell-to-cell contact and autocrine/paracrine signaling) and intrinsic factors from stimulation in flow (autonomous signaling/mutations in NF-κB pathway) contribute to NF-κB activity. Upon static inflammatory stimulation with TNF-α, we demonstrated that the two cell types were characterized by different p65 dynamics: stromal cells were able to resolve p65 nuclear translocation after some time, while MM.1S cells tended to maintain a sustained p65 activation, without particular oscillatory dynamics in both cell types. Importantly, we found a strong single-cell heterogeneity in both populations that we were able to capture with specific conceived quantitative descriptors. Moreover, ELISA assay excluded degradation of TNF-α after 8 hours of live imaging. NF-κB description was further characterized to verify how clinical anti-MM treatments (Bortezomib and Lenalidomide) act on NF-κB sustained activation in MM cells. In TNF-stimulated MM.1S, NF-κB activation was reduced by a concomitant treatment with Bortezomib and Lenalidomide, alone and in combination. Bortezomib was effective both in terms of cancer cell death and NF-κB inhibition in a dose-dependent manner, while Lenalidomide inhibited NF-κB at low concentrations, without observable cytotoxicity. Co-treating cells with both drugs at lower concentrations induced stronger p65 inhibition than the single drug treatment at high concentrations. To exclude extrinsic factor influences on NF-κB modulation, MM.1S and HS-5 were cultured in advanced microfluidic platforms where medium containing TNF-α reached cells through continuous flow, while washing away any released cytokines. Although a single copy loss in the gene of the main inhibitor of NF-κB in MM.1S, both cells exhibited a comparable and more sustained p65 activation than static setting, meaning that extrinsic factors influenced p65 modulation differently in stromal and myeloma cells in static stimulation. Focusing on autocrine/paracrine signals, analysis of supernatants from both cells in unstimulated and TNF-stimulated setting, revealed a dissimilar cytokines cocktail composition, that can act on p65 quenching, moving from continuous to static flow, with increased ability of stromal cells in returning to basal levels. We then performed a single-cell RNA sequencing on 4 hours MM-stroma co-culture to investigate the effects on NF-κB activity of both cell-to-cell contact and autocrine/paracrine signaling and the molecular mechanisms behind them in the context of the interaction between the two cell types. MM.1S experienced a significative change in the transcriptome profile upon co-culture with stromal cells; however, no NF-κB activation was detected. Because NF-κB activation upon MM-stroma co-cultures might be transient, we exploited again quantitative live imaging of MM.1S and HS-5 cultured together. Without stimulation, MM in co-culture exhibited statistically higher mean p65 NCI than MM.1S alone but below the threshold of activation reached upon TNF-α. By introducing IL-1β, which we previously demonstrated activates p65 in HS-5 only, released factors from inflamed stroma did not impact on MM p65 translocation. This result can indeed be associated to large volumes diluting the soluble factors below their activation thresholds. To investigate how stromal cells-mediated paracrine signaling acts on MM, a custom-made microfluidic device was conceived to recreate a more controlled, microscopic and three dimensional tumoral environment. The device was realized in a two-layer conformation: the first layer was composed of two symmetrical culture channels destinated to 3D cultures of MM.1S and HS-5 inside fibrin gels which simulated the ECM-like material around the BM. The two 3D cultures, originally separated, can be connected using Doormat valves controlled by the top pneumatic layer. Upon different essential validations, the device was employed, at first, to recapitulate some of the NF-κB activation trends observed in 2D cultures. Up to now, the most striking result obtained with the microfluidic platform was the heterogeneous activation of p65 in myeloma cells once the paracrine factors from stromal inflammatory environment reached the MM compartment, thanks to the pneumatic layer actuation. This result was not achievable in 2D macroscopic co-culture of MM.1S and IL-1β-stimulated HS-5, highlighting the importance of new user-friendly in vitro solutions to better mimic the tumor microenvironment. The innovative techniques presented in this PhD thesis were fundamental to investigate NF-κB dynamics in Multiple Myeloma and bone marrow stromal cells. Overall, this characterization and optimized set-up could lead to a deeper knowledge of MM biology and physiopathology.

NF-κB è una famiglia di fattori di trascrizione coinvolti nella sopravvivenza delle cellule, nella produzione di citochine e nella risposta immunitaria. In condizioni fisiologiche, NF-κB risiede inattivo nel citoplasma; tuttavia, segnali extracellulari possono attivare NF-κB, che si sposta nel nucleo dove promuove la trascrizione di diversi geni, inclusi i propri inibitori; questi ultimi agiscono da feedbacks negativi per evitare l’errato funzionamento di NF-κB. La deregolazione e l'iper-attivazione di NF-κB sono tra le cause dello sviluppo del Mieloma Multiplo (MM), la seconda neoplasia ematologica più comune in Italia e negli Stati Uniti. Le frequenti ricadute e la resistenza paziente-specifica ai farmaci rendono il MM ancora un tumore incurabile. In questo progetto di dottorato ci siamo posti come obiettivo la caratterizzazione, per la prima volta, delle dinamiche di NF-κB in cellule vive di mieloma e dello stroma del midollo osseo, per comprendere meglio la biologia di questa malattia. Per questo specifico scopo, abbiamo sfruttato un approccio bio-ingegneristico con tecniche all'avanguardia, quali single-cell live imaging e microfluidica. Per sfruttare i vantaggi dell'imaging dal vivo con risoluzione a singola cellula, la prima parte del lavoro è stata dedicata al tag endogeno della nostra proteina di interesse, p65, una subunità della famiglia NF-κB. Mediante CRISPR/Cas9, siamo riusciti ad ottenere l’inserzione della proteina fluorescente YFP al C terminale di p65 in due linee cellulari: MM.1S, come linea cellulare tumorale di mieloma multiplo, e HS-5, rappresentativa delle cellule stromali. Dopo aver validato il nostro modello cellulare, abbiamo descritto tramite quantificazioni con MATLAB, le dinamiche di p65 in termini di rapporto di intensità nucleare su quella citoplasmatica, una grandezza dipendente esclusivamente dai livelli nucleari di p65, poiché abbiamo dimostrato che la quantità totale di p65 nelle nostre cellule è costante. Entrambe le linee cellulari sono state sottoposte a stimolazione infiammatoria statica o in flusso mediante il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α). Particolare attenzione è stata dedicata a separare l’influenza sull’attivazione di NF-κB dei fattori estrinseci della stimolazione statica (contatto cellula-cellula e signaling autocrino/paracrino) dai fattori intrinseci della stimolazione in flusso (mutazioni nei geni target di NF-κB). A seguito di stimolazione infiammatoria con TNF-α in condizioni statiche, abbiamo dimostrato che i due tipi cellulari erano caratterizzati da differenti dinamiche di p65: le cellule stromali erano in grado di risolvere la traslocazione nucleare di p65 a fine esperimento, mentre le MM.1S tendevano a mantenere un'attivazione sostenuta di p65. Entrambe le popolazioni cellulari non mostravano particolari dinamiche oscillatorie. È importante sottolineare che abbiamo trovato inoltre una forte eterogeneità di risposta all’interno delle due linee cellulare che abbiamo analizzato mediante specifici quantificatori. Infine, mediante l’assay ELISA, abbiamo escluso la degradazione del TNF-α dopo 8 ore di live imaging. Successivamente, abbiamo verificato come i farmaci contro il mieloma (Bortezomib e Lenalidomide) agiscano sulla sostenuta attivazione di NF-κB nelle MM.1S. Quest’ultime sono state quindi sottoposte a trattamento concomitante di Bortezomib o Lenalidomide, da soli e in associazione con TNF-α. Bortezomib è risultato efficace sia in termini di morte cellulare che di inibizione di NF-κB in maniera dose-dipendente, mentre Lenalidomide ha dimostrato inibire NF-κB a basse concentrazioni, senza però apparentemente agire sulla citotossicità. Il co-trattamento delle cellule con entrambi i farmaci a ridotte concentrazioni ha indotto una maggiore inibizione di p65 rispetto al trattamento con uno dei singoli farmaci ad alte concentrazioni. Per escludere l'influenza dei fattori estrinseci sulla modulazione di NF-κB, piastre commerciali di microfluidica sono state utilizzate per stimolare MM.1S e HS-5 con flusso continuo di TNF-α, lavando via qualsiasi citochina rilasciata. Sebbene le MM.1S presentino una mutazione nel gene del principale inibitore di NF-κB, entrambe le cellule hanno mostrato un'attivazione di p65 paragonabile tra loro e più sostenuta rispetto alla coltura statica. I fattori estrinseci hanno influenzato quindi la differente modulazione di p65 nelle cellule stromali o di mieloma nella stimolazione statica. Concentrandosi sui solo fattori autocrini/paracrini, l'analisi dei supernatanti di entrambe le linee cellulari, in ambiente non stimolato e stimolato da TNF-α, ha rivelato la presenza di citochine differenti rilasciate dallo stroma o dalle cellule tumorali, che può aver agito sulla diminuzione di NCI di p65 passando dal flusso continuo a stimolazione statica, con una maggiore capacità nelle cellule stromali di tornare a livelli basali. A questo punto, per studiare gli effetti sull'attività di NF-κB sia del contatto cellula-cellula che del signaling autocrino/paracrino e per capire quali siano i meccanismi molecolari alla base di essi nel contesto dell’interazione tra i due tipi cellulari, abbiamo effettuato un single-cell RNA sequencing di una co-coltura di 4 ore di MM.1S e HS-5. Le MM.1S hanno risentito un cambiamento trascrizionale in seguito alla co-coltura con cellule stromali, tuttavia, senza rilevazione dell’attivazione di NF-κB. Poiché tale attivazione potrebbe essere transitoria, abbiamo sfruttato di nuovo l'imaging quantitativo di MM.1S e HS-5 insieme. Senza stimolazione, il MM in co-coltura con lo stroma ha mostrato un incremento dell’attività basale rispetto alle MM.1S da sole. Introducendo IL-1β, che selettivamente attiva solo p65 nello stroma, i fattori rilasciati dalle HS-5 non hanno agito invece sulla traslocazione di p65 nel MM. Questo risultato può essere legato ai grandi volumi della coltura 2D, che possono aver diluito i fattori solubili al di sotto delle loro soglie di attivazione. Per studiare come il signaling paracrino mediato dalle cellule stromali agisca sul MM, è stato concepito un dispositivo microfluidico per ricreare un ambiente tumorale più controllato, microscopico e tridimensionale. Il dispositivo è stato realizzato a due layers: il primo è composto da due canali di coltura simmetrici destinati alla coltura 3D di MM.1S e HS-5 all'interno di gel di fibrina per simulare la matrice extracellulare; le due colture 3D, originariamente separate, vengono collegate tramite l'utilizzo di valvole Doormat, controllate dal secondo layer pneumatico. Dopo diverse validazioni essenziali a validare il funzionamento del device, il dispositivo è stato inizialmente utilizzato per riepilogare alcune delle osservazioni fatte in 2D. Il risultato più eclatante finora ottenuto con il device è stata l'attivazione, seppur eterogenea, di p65 nelle cellule del mieloma quando i fattori paracrini provenienti dall'ambiente infiammatorio stromale hanno raggiunto per diffusione il compartimento del MM, grazie all’attuazione delle valvole. Nella co-coltura macroscopica 2D di MM.1S e HS-5 stimolate da IL-1β, questo risultato non è stato rilevato, evidenziando l'importanza di nuove soluzioni in vitro per ricostruire il microambiente tumorale. In conclusione, le tecniche innovative presentate in questa tesi di dottorato sono state fondamentali nella caratterizzazione delle dinamiche di NF-κB in cellule vive di mieloma multiplo e stromali del midollo osseo. Nel complesso, questa caratterizzazione e set-up ottimizzato potrebbero portare a una conoscenza più approfondita della biologia e fisiopatologia del MM.