Design and development of compartmentalized microfluidic platforms for the in vitro reconstruction of neural networks and their application to the in vitro modeling of Parkinson's disease

The introduction of microfluidic compartmentalized platforms allowed to develop in vitro models of the nervous system that both mimic the in vivo neuronal organization and allow the analysis of local, sub-cellular signals on single axons. These platforms are promising solutions to investigate neuronal behavior both in physiological conditions and in case of neuronal disorders, such as neurodegenerative diseases. This thesis project was divided in two parts, each of which focused on compartmentalized microfluidic platforms to recapitulate neuronal networks. The first part builds upon a compartmentalized microfluidic platform previously developed by our research group, which allows to co-culture two different CNS neuronal populations and manipulate the synapses. The work was focused on a comprehensive technical characterization of the device and of the perfusion mechanism, as well as on a biological validation to use the platform to investigate Parkinson’s disease. In particular, we aimed at recapitulating a neuronal circuitry made of Dopaminergic neurons (DA) and medium spiny neurons (MSN) differentiated from wild type (WT) iPSCs, and subsequently evaluating the effect of exposing neurons to intoxicants typically used in PD models. The biological experiments aimed to investigate the destruction on synaptic terminals after selective intoxication, in order to further assess whether neural phenotypes of the circuit have a different sensitivity to oxidative stress, involved in degeneration. Another important aim was to investigate the uptake of neurotoxic aggregated fibrils upon synapses. The second part of the thesis aimed at developing a novel tri-compartmentalized platform, to increase the complexity of the recapitulated neuronal networks and allow the co-culture of three different neuronal phenotypes, i.e. dopaminergic, cortical and medium spiny neurons. In particular, we aimed at recapitulating a poly-functional synapse constituted by two inputs of DA and cortical neurons, on a MSN output. The work was focused on the design of three possible versions of the platform, followed by a comprehensive technical characterization and a preliminary biological validation using human iPSC-derived neurons, aiming at optimizing culture parameters and assessing whether proper synaptic connections are formed.

L'introduzione di piattaforme microfluidiche compartimentate ha permesso di sviluppare modelli in vitro del sistema nervoso che imitano l'organizzazione neuronale in vivo e permettono l'analisi di segnali locali e subcellulari su singoli assoni. Queste piattaforme sono soluzioni promettenti per studiare il comportamento neuronale sia in condizioni fisiologiche che in caso di disturbi neuronali, come le malattie neurodegenerative. Questo progetto di tesi è stato diviso in due parti, ognuna delle quali si è concentrata su piattaforme microfluidiche compartimentate per ricapitolare le reti neuronali. La prima parte si basa su una piattaforma microfluidica compartimentata precedentemente sviluppata dal nostro gruppo di ricerca, che permette di co-coltivare due diverse popolazioni neuronali del SNC e manipolare le sinapsi. Il lavoro si è concentrato su una caratterizzazione tecnica completa del dispositivo e del meccanismo di perfusione, così come su una convalida biologica per utilizzare la piattaforma per studiare il morbo di Parkinson. In particolare, abbiamo mirato a ricapitolare un circuito neuronale composto da neuroni dopaminergici (DA) e neuroni a spina media (MSN) differenziati da iPSCs wild type (WT), e successivamente valutare l'effetto dell'esposizione dei neuroni a intossicanti tipicamente utilizzati nei modelli di PD. Gli esperimenti biologici miravano a indagare la distruzione sui terminali sinaptici dopo intossicazione selettiva, al fine di valutare ulteriormente se i fenotipi neurali del circuito hanno una diversa sensibilità allo stress ossidativo, coinvolto nella degenerazione. Un altro importante obiettivo era quello di indagare l'assorbimento delle fibrille aggregate neurotossiche sulle sinapsi. La seconda parte della tesi mirava a sviluppare una nuova piattaforma tri-compartimentale, per aumentare la complessità delle reti neuronali ricapitolate e permettere la co-coltura di tre diversi fenotipi neuronali, cioè neuroni dopaminergici, corticali e MSN. In particolare, abbiamo mirato a ricapitolare una sinapsi polifunzionale costituita da due ingressi di neuroni DA e corticali, su un'uscita MSN. Il lavoro si è concentrato sulla progettazione di tre possibili versioni della piattaforma, seguita da una caratterizzazione tecnica completa e da una validazione biologica preliminare utilizzando neuroni umani derivati da iPSC, al fine di ottimizzare i parametri di coltura e valutare se si formano connessioni sinaptiche adeguate.