Towards a microfluidic platform for single cell analysis: a device for detecting circulating tumour cells

Taking a look at the overall world mortality factors, it is clear how nowadays long-term diseases play a major role. Among these, cancer, due to its insidious and heterogeneous nature, holds a prominent place. Besides the impressive improvements in the field of medicine and diagnostics, the battle against this disease is still harsh. To further increase the chances to win this clash, being able to detect the presence of such a condition in its early stages of development, during its “silent” phase, is a key factor. We still lack a complete picture of the mechanisms that lead to the unnatural and disproportionate growth of tumoral masses. However, it is clear that, for multiple, complex and partially unknown reasons, some cells in our organism, at a given time, may change their behaviour and start affecting the hosting organs. Since the earliest phases of the primary tumoral mass development, some of these cells move from their original site and penetrate the blood circulation to reach distal organs and give rise to new cancerous sites. This mechanism is acknowledged as the cause of the onset of new metastases and the cells responsible for this are called Circulating Tumoral Cells (CTCs). The study and the characterization of these cells – which are very heterogeneous, depending both on their organ of origin and on their development stage – can bring tremendous advantages in the fight against cancer. They could be easily accessed by a simple blood drawing and their number can be correlated with the presence of an ongoing tumoral growth up to 4 years before other techniques could detect the mass. Furthermore, their occurrence in a blood sample can be linked to the patient prognosis and can be used as an index to monitor therapy efficiency. Lastly, if extracted and analysed, they can unveil precious information that could help to shift towards a more “personalised medicine”. However, their detection and extraction are hampered by several factors. Besides their great heterogeneity, their extremely low frequency in a blood sample is a very challenging impediment to overcome. In one mL of whole blood there can be found up to 109 erythrocytes, 106 leukocytes and only 1-100 CTCs, if present. This means that normal bench-top technologies, used to process great volume of samples, may provide a too low sensitivity to be able to accurately detect the presence of such cells. For this reason, in the recent years, many works have implemented microfluidic strategies – under the name of lab-on-a-chip (LOC) devices – to address this issue. These solutions, thanks to their intrinsic features – i.e., characteristic dimensions of the order of magnitude of the analytes, small sample volume consumption, and high integrability– promise to have the potential to achieve high-sensitivity, high-specificity, cost-effective and portable performances. However, there is still the lack of a platform able to detect these cells and count them, in a complete label-free way and featuring throughputs high enough to process a blood sample within few hours. For these reasons, the project at the heart of this thesis has been conceived. The underlying concept is the creation of an integrated microfluidic platform for the label-free detection of CTCs in three main steps. The first step implements an in-flow blood filtration to discard as much red blood cells (RBC) as possible, based on their size. Indeed, from the literature it is well known how erythrocytes and CTCs show a significant difference in dimensions – around 6-7 μm for RBCs and 12-35 μm for CTCs. The second step is a hydrodynamic focusing of the remaining particles. This technique allows to manipulate the particle position in a microfluidic channel, by making them flow precisely at the centre of the cross-section. In this way, the cells are aligned and distributed, one behind the other, to significantly improve the performances of the third step. Indeed, in the last stage the platform would perform a single-cell analysis that allows to discriminate between white blood cells (WBCs) and CTCs. Thus, the goal of this thesis has been to carry out a feasibility analysis, design, fabricate and test a proof of concept for each of the above-described steps. Since the high versatility required, femtosecond laser irradiation, followed by chemical etching (FLICE) technique has been adopted as the main manufacturing process. Regarding the first step, hydrodynamic filtering has been selected as optimal strategy to implement the required functionality. By carrying out numerical simulations and microfluidics experiments, a new crossflow filtering geometry has been developed, showing high throughputs (up to tens of mL/h) and a completely clogging-free operativity. The efficiency in the separation ranges from 63%-75% for a single round of filtering, but it can be improved up to 94% by taking three rounds subsequently. Instead, the recovery rate of larger particle is 100%. To achieve a precise 3D alignment of particles within a microfluidic channel, a unique geometry has been designed, fabricated, and tested. The great 3D potentialities of FLICE technique have been exploited to fabricate a channel nested within a larger channel, attaining the precise alignment of particles of different sizes – 15 μm, 6 μm, and 1μm –, by using the same device, and the minimum focused flow has reached a cross-section of 9 μm x 5 μm. For the single-cell analysis step, two main strategies have been identified: deformability assessment of cells and on-chip Raman spectroscopy. Since tumoral cells show a different deformability with respect to the other blood cells, an easy-to-use, high throughput, and robust optofluidic device has been manufactured to measure it. The geometry consists in a straight channel with a bottleneck to force cells to deform and two pairs of optical fibres to measure the cell transit times. Thus, this quantity can be correlated with their deformability. A proof of concept has been carried out by flowing breast cancer cells (MCF-7) and by measuring their transit times. In a second test, the deformability of the cells has been modified, increasing it, by treating them with a drug (Latrunculin-A). The comparison of the transit times has showed that drug-treated cells require around 0.5 ms more to cross the bottleneck. Regarding the on-chip Raman spectroscopy, a new strategy has been proposed. Since the Raman signal is well known for its weakness, the proposed solution is to integrate, near to microfluidic channels, optical structures to increase the solid angle of acquisition. From the literature, it is known that the maximum value of harvested solid angle reaches 28% in the case of a water immersion objective. In this thesis it has been demonstrated, through numerical simulations, that structures such as parabolic mirrors, could improve this value to 56%. Thus, such optical structures have been designed and fabricated, introducing an optical polishing step, by means of a CO2 laser, to enhance the quality of the created elements. Thanks to this additional step very high-quality optical structures have been fabricated (RMS of 3 nm) and a focal spot of 50 μm has been obtained. The same fabrication process has been used to fabricate elliptical mirrors as well and, in this case, the spot is ~ 30 μm wide. In conclusion, in this thesis the versatility of FLICE technique has been exploited to design and fabricate a wide range of innovative elements, that can be integrated on the same platform to reach a micro total analysis system (μTAS) for CTCs detection and counting.

Dando uno sguardo ai fattori globali di mortalità mondiale, è chiaro come al giorno d'oggi le malattie a lungo termine giochino un ruolo importante. Tra queste, il cancro, a causa della sua natura insidiosa ed eterogenea, occupa un posto di rilievo. Oltre agli impressionanti miglioramenti nel campo della medicina e della diagnostica, la battaglia contro questa malattia è ancora dura. Per aumentare ulteriormente le possibilità di vincere questo scontro, essere in grado di rilevare la presenza di tale condizione nelle sue prime fasi di sviluppo, durante la sua fase "silenziosa", è un fattore chiave. Non abbiamo ancora un quadro completo dei meccanismi che portano alla crescita innaturale e sproporzionata delle masse tumorali. Tuttavia, è chiaro che, per ragioni multiple, complesse e parzialmente sconosciute, alcune cellule del nostro organismo, in un dato momento, possono cambiare il loro comportamento e iniziare a colpire gli organi ospitanti. Fin dalle prime fasi dello sviluppo della massa tumorale primaria, alcune di queste cellule si spostano dalla loro sede originale e penetrano nella circolazione sanguigna per raggiungere gli organi distali e dare origine a nuovi siti cancerosi. Questo meccanismo è riconosciuto come la causa dell'insorgenza di nuove metastasi e le cellule responsabili di ciò sono chiamate cellule tumorali circolanti (CTC). Lo studio e la caratterizzazione di queste cellule - che sono molto eterogenee, a seconda del loro organo di origine e del loro stadio di sviluppo - può portare enormi vantaggi nella lotta contro il cancro. Possono essere facilmente accessibili con un semplice prelievo di sangue e il loro numero può essere correlato alla presenza di una crescita tumorale in corso fino a 4 anni prima che altre tecniche possano rilevare la massa. Inoltre, la loro presenza in un campione di sangue può essere collegata alla prognosi del paziente e può essere utilizzata come indice per monitorare l'efficacia della terapia. Infine, se estratti e analizzati, possono svelare informazioni preziose che potrebbero aiutare a passare a una "medicina più personalizzata". Tuttavia, la loro individuazione ed estrazione è ostacolata da diversi fattori. Oltre alla loro grande eterogeneità, la loro frequenza estremamente bassa in un campione di sangue è un ostacolo molto impegnativo da superare. In un mL di sangue intero si possono trovare fino a 109 eritrociti, 106 leucociti e solo 1-100 CTC, se presenti. Questo significa che le normali tecnologie da banco, utilizzate per elaborare grandi volumi di campioni, possono fornire una sensibilità troppo bassa per essere in grado di rilevare con precisione la presenza di tali cellule. Per questo motivo, negli ultimi anni, molti lavori hanno implementato strategie microfluidiche - sotto il nome di dispositivi lab-on-a-chip (LOC) - per affrontare questo problema. Queste soluzioni, grazie alle loro caratteristiche intrinseche - cioè dimensioni caratteristiche dell'ordine di grandezza degli analiti, piccolo consumo di volume di campione e alta integrabilità - promettono di avere il potenziale per ottenere prestazioni ad alta sensibilità, alta specificità, convenienti e portatili. Tuttavia, c'è ancora la mancanza di una piattaforma in grado di rilevare queste cellule e contarle, in un modo completo senza etichetta e con throughput abbastanza alto per elaborare un campione di sangue in poche ore. Per questi motivi è stato concepito il progetto al centro di questa tesi. Il concetto di base è la creazione di una piattaforma microfluidica integrata per la rilevazione senza etichetta di CTCs in tre fasi principali. Il primo passo implementa una filtrazione del sangue in-flow per scartare quanti più globuli rossi (RBC) possibile, in base alle loro dimensioni. Infatti, dalla letteratura è ben noto come gli eritrociti e le CTC mostrino una significativa differenza di dimensioni - circa 6-7 μm per i RBC e 12-35 μm per le CTC. Il secondo passo è una focalizzazione idrodinamica delle particelle rimanenti. Questa tecnica permette di manipolare la posizione delle particelle in un canale microfluidico, facendole scorrere esattamente al centro della sezione trasversale. In questo modo, le cellule sono allineate e distribuite, una dietro l'altra, per migliorare significativamente le prestazioni della terza fase. Infatti, nell'ultima fase la piattaforma eseguirebbe un'analisi di una singola cellula che permette di discriminare tra globuli bianchi (WBC) e CTC. Quindi, l'obiettivo di questa tesi è stato quello di effettuare un'analisi di fattibilità, progettare, fabbricare e testare una prova di concetto per ciascuna delle fasi sopra descritte. Poiché l'alta versatilità richiesta, l'irradiazione laser a femtosecondi, seguita dalla tecnica di incisione chimica (FLICE) è stata adottata come principale processo di fabbricazione. Per quanto riguarda la spettroscopia Raman su chip, è stata proposta una nuova strategia. Poiché il segnale Raman è ben noto per la sua debolezza, la soluzione proposta è di integrare, vicino ai canali microfluidici, strutture ottiche per aumentare l'angolo solido di acquisizione. Dalla letteratura, si sa che il valore massimo dell'angolo solido raccolto raggiunge il 28% nel caso di un obiettivo ad immersione in acqua. In questa tesi è stato dimostrato, attraverso simulazioni numeriche, che strutture come gli specchi parabolici, potrebbero migliorare questo valore al 56%. Così, tali strutture ottiche sono state progettate e fabbricate, introducendo un passo di lucidatura ottica, per mezzo di un laser CO2, per migliorare la qualità degli elementi creati. Grazie a questo passo aggiuntivo sono state fabbricate strutture ottiche di altissima qualità (RMS di 3 nm) ed è stato ottenuto un punto focale di 50 μm. Lo stesso processo di fabbricazione è stato utilizzato per fabbricare anche specchi ellittici e, in questo caso, lo spot è largo ~ 30 μm. In conclusione, in questa tesi la versatilità della tecnica FLICE è stata sfruttata per progettare e fabbricare una vasta gamma di elementi innovativi, che possono essere integrati sulla stessa piattaforma per ottenere un micro sistema di analisi totale (μTAS) per il rilevamento e il conteggio dei CTC.