Development of a microscope on chip for 1D super resolution imaging of single cell

In the last decade, great advancements have been done in optofluidics, with increasing integration of optical structures and microfluidic channels on the same platform, allowing the implementation of optical imaging techniques on lab on-chip systems. Such devices, named microscopes on-chip (MOCs), can combine the features of a microscope on a small, compact, portable and automated chip, being suitable for high troughput investigations and large scale applications, such as point of care of diagnostics, environmental monitoring or field analysis and in situ measurements. The implementation of these structures is technically challenging, due to the need of fabricating different components on the same substrate. Among different method, an enabling approach is constituted by Femtosecond Laser Micromachining (FLM). This is a relatively novel technique which allows the fabrication on the same substrate of both microfluidic channels for the sample manipulation, and optical structures for delivering of light to the biological specimen investigated. One of the most promising imaging technique that can be integrated on this kind of devices is selective plane illumination microscopy (SPIM). It exploits the benefits of fluorescence imaging, thus low background signal and labelling of distinct structures, together with the capability of illuminating the sample with a light-sheet, obtaining an optical sectioning. In this way, scanning plane-by-plane the sample, the whole 3D structure can be reconstructed, with low photo-toxicity and photo-bleaching, being feasible to be used on living specimens too. Another microscopy technique that can be combined with SPIM is structured illumination microscopy (SIM). This imaging method allows the enhancement of the lateral resolution limit of the system beyond the diffraction limit by exploiting a frequency mixing mechanism. The sample has to be illuminated with a pattern of light which is translated during the illumination. Tipically, the structured illumination is generated by the interference of multiple beams and the translation is performed changing the optical path of one of them. This master thesis has been carried out in the context of an european project, whose purpose is to develope a microscope on-chip which integrates these two imaging techniques. FLM is exploited in order to realize a device which can generate an interference pattern from the superposition of multiple light-sheets, where the translation is obtained changing the phases of one beam with respect to the others using a thermal shifter. This work aims at fabricating and validating all the components required for the development of a two beams version of this MOC, where the pattern results from the interference of two inclined light-sheets, allowing for 1D super resolution imaging. Both the optical and the microfluidic sections have been realized using the FLM technique, then, the optical connections between them has been implemented. Finally, single cell imaging has been performed using the developed device.

Negli ultimi anni sono stati fatti grandi passi avanti nello studio dell'optofluidica, ottimizzando sempre più l'integrazione di strutture ottiche e canali microfluidici sullo stesso dispositivo, permettendo di implementare tecniche di microscopia su sistemi lab-on-chip. Questi dispositivi vengono chiamati microscopi su chip (MOCs), e combinano le caratteristiche di un normale microscopio su un sistema compatto, di dimensioni ridotte e semplice da utilizzare. I microscopi integrati trovano applicazione nei campi, quali biologia e medicina, in cui è richiesta l'analisi di un numero statisticamente significativo di campioni, grazie all'aumentata automazione delle analisi. Fra le varie tecniche di lavorazione un metodo molto conveniente per fabbricare dispositivi integrati è sicuramente la Microlavorazione con Laser a Femtosecondi (FLM), che permette di fabbricare su un unico substrato componenti microfluidiche e ottiche, usate rispettivamente per il movimento del campione biologico da analizzare e la sua illuminazione. Una delle tecniche di microscopia più promettenti che può essere sviluppata su chip è la selective plane illumination microscopy (SPIM). Questo metodo unisce i benefici della microscopia a fluorescenza, ovvero basso rapporto segnale rumore e possibilità di marcare strutture diverse del campione, con la possibilità di illuminare il campione con un foglietto di luce, ottenendo un sezionamento ottico. L'intera struttura tridimensionale viene ricostruita illuminando piano per piano il campione analizzato, riducendo gli svantaggi legati all'illuminazione completa come il fotobleaching e la fototossicità, questo permette di utilizzare questa tecnica anche su campioni biologici vivi e non necessariamente tagliati e fissati. Un'altra tecnica di microscopia che può essere combinata con la SPIM è la structured illumination microscopy (SIM), che permette di migliorare la risoluzione laterale dell'immagine oltre il limite della diffrazione, tramite un meccanismo di mixing delle frequenze spaziali. Il campione viene illuminato con un pattern di luce che viene traslato in modo da ottenere un'illuminazione uniforme. Il pattern può essere generato da più fasci sovrapposti che interferiscono e traslato inducendo uno sfasamento in uno di questi. Questo lavoro di tesi è stato svolto nell'ambito di un progetto europeo, il cui obiettivo è realizzare un microscopio su chip che integri entrambe queste tecniche di microscopia. Le diverse componenti possono essere realizzate sfruttando la tecnica di microlavorazione con laser a femtosecondi, in modo da fabbricare un dispositivo che possa generare un pattern di interferenza dalla sovrapposizione di più fasci di luce, che a sua volta viene traslato inducendo uno sfasamento nel cammino ottico di uno dei fasci tramite uno sfasatore termico. Nello specifico, presenterò la fabbricazione e ottimizzazione delle componenti richieste per lo sviluppo di una versione a due fasci di luce di questo microscopio su chip. Il pattern verrà generato dall'interferenza di due foglietti di luce inclinati uno rispetto all'altro, permettendo di ottenere immagini con un miglioramento della risoluzione in una dimensione. Sia la parte ottica che quella microfluidica sono state fabbricate utilizzando la tecnica FLM, mentre la connessione ottica tra le due parti è stata realizzata in fibra. Infine, il dispositivo finale è stato utilizzato per fare imaging di singole cellule.