The role of fluid flow on biofilm formation by bacteria isolated from biliary stents

Bacterial biofilms, recognized as the most successful form of life on earth, have implications in a broad range of fields including, but not limited, to clinical microbiology, biotechnology, and marine ecology. Traditional microbiological techniques study bacteria in static and uniform conditions at the population scale, that do not mimic the actual physiological environments of biofilms. Microfluidics offer the current needed mechanism to study biofilm formation in dynamic conditions by enabling observations at high spatial and temporal resolution in carefully controlled microenvironments. In this thesis, the potential of microfluidics was exploited to investigate how fluid flow influences biofilm formation processes by clinically relevant bacteria. It was designed and optimized a microfluidic platform to examine bacterial responses to different shear stress conditions as well as various nutrient concentrations. Specifically, bacterial attachment kinetics and extracellular polymeric substances secretion at the population-scale were monitored using phase-contrast and epifluorescence microscopy in controlled fluid flow environments. Biofilm formation experiments were performed at different flow for ‘strong biofilm-former’ strains associated with biliary stents: Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca, and Citrobacter freundii. It was found that hydrodynamic stresses stimulate bacterial organization and the production of extracellular DNA on a surface compared to the static condition. Additionally, conditions characterized by a high flow rate and nutrient depletion accelerate extracellular polymeric substances secretion despite a lower coverage of the confining surface. These results represent a first step towards the understanding of mechanisms for bacterial survival and proliferation in clinical environments. These data then pushed the project towards studying whether the production of extracellular substances under flow may trigger the development of thread-like biofilms, known as streamers. It is described the capacity of strains associated with biliary stents to form thread-like biofilms, in microfluidic channels with turns or with the presence of a pillar at the center of the channel. All the strains of interest showed the ability to form streamers, in particular the patient isolated strains of E. cloacae, K. oxytoca, and C. freundii. Finally, the microfluidic set-up was used to evaluate the antibiofilm effect of different formulations in collaboration with the group of Prof. Maria Rescigno at Humanitas. Two postbiotics and two controls were analyzed by identifying their interaction with three bacterial strains. All the tests were carried out for each bacterial strain using different strategies to recognize whether the postbiotic affects bacterial attachment or biofilm growth. Also, dose-response as well as the duration of the treatment were evaluated and quantified. This microfluidic approach allows understanding the working principle of these new treatments and studying each component separately.

I biofilm batterici, riconosciuti come la forma di vita di maggior successo sulla terra, hanno implicazioni in un'ampia gamma di campi inclusi, ma non limitati alla microbiologia clinica, la biotecnologia e l'ecologia marina. Le tecniche microbiologiche tradizionali studiano popolazioni di batteri in condizioni statiche e uniformi, che non imitano gli ambienti fisiologici reali dei biofilm. La microfluidica offre il meccanismo necessario per studiare la formazione di biofilm in condizioni dinamiche consentendo osservazioni ad alta risoluzione spaziale e temporale in microambienti attentamente controllati. In questa tesi, il potenziale della microfluidica è stato sfruttato per studiare come il flusso idrodinamico influenzi i processi di formazione del biofilm da parte di batteri clinicamente rilevanti. È stata progettata e ottimizzata una piattaforma microfluidica per esaminare le risposte batteriche a diverse condizioni di sforzo di taglio, nonché a varie concentrazioni di nutrienti. In particolare, la cinetica di attacco batterico e la secrezione di sostanze polimeriche extracellulari sono state monitorate nella popolazione mediante microscopia a contrasto di fase ed epifluorescenza in ambienti a flusso controllato. Sono stati eseguiti esperimenti di formazione di biofilm a condizioni di flusso diversi per ceppi formatori di biofilm associati a stent biliari: Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca e Citrobacter freundii. È stato scoperto che gli stress idrodinamici stimolano l'organizzazione batterica e la produzione di DNA extracellulare su una superficie rispetto alla condizione statica. Inoltre, condizioni caratterizzate da un'elevata portata e riduzione di nutrienti accelerano la secrezione di sostanze polimeriche extracellulari nonostante una minore copertura della superficie. Questi risultati rappresentano un primo passo verso la comprensione dei meccanismi di sopravvivenza e proliferazione batterica in ambienti clinici. I risultati ottenuti hanno portato lo studio a verificare la produzione di sostanze extracellulari in forma di biofilm filiformi, noti come streamer. In questo elaborato, viene descritta la capacità dei ceppi associati agli stent biliari di formare biofilm filiformi, in canali microfluidici curvi o con presenza di un pilastro al centro del canale. Tutti i ceppi di interesse hanno mostrato la capacità di formare streamer, in particolare i ceppi isolati da pazienti di E. cloacae, K. oxytoca e C. freundii. Infine, il set-up microfluidico è stato utilizzato per valutare l'effetto antibiofilm di diverse formulazioni in collaborazione con il gruppo della Prof.ssa Maria Rescigno presso Humanitas. Sono stati analizzati due postbiotici e due controlli identificando la loro interazione con tre ceppi batterici. Tutti i test sono stati effettuati per ogni ceppo batterico utilizzando diverse strategie per riconoscere se il postbiotico influenza l'attaccamento batterico o la crescita del biofilm. Inoltre, sono state valutate e quantificate la dose-risposta e la durata del trattamento. Questo approccio microfluidico consente di comprendere il principio di funzionamento di questi nuovi trattamenti e di studiare ogni componente separatamente.