TMEK: a lab on chip diagnostic test for selective capture and detection of magnetic fingerprints of malaria

Over the past decades, Point of Care (PoC) testing has progressively been established as one of the most promising technology in the fight against the spreading of infectious diseases. Nevertheless, as medicine is blind without accurate and fast diagnostic, the research in this area is still an open issue and it is always looking for new solutions. Recently, the World Health Organization, also in the wake of the COVID-19 pandemic, has called for an urgent global collaboration to develop tests able to reduce the spread of infections due to major pathogens, including malaria parasite, human immunodeficiency virus (HIV), Dengue and Zika viruses or Mycobacterium tuberculosis (TB). To the scope, the focus of this thesis work is on TMek, a social project, and in particular on its main goals and original contributions achieved in the fields of malaria PoC testing. Nowadays, according to the World Health Organization (WHO), malaria is one of the most common life-threatening infectious diseases and a global public health challenge. In 2019, around 229 million cases were registered with an estimated 409000 deaths worldwide. The majority of these, around 93%, occurred in sub-Saharan Africa where the population exposed to the highest risk of death is composed by children aged under 5 years old, as in this case the disease could easily evolve towards severe malaria, and in pregnant women that are unable to clear infections due to a physiological decrease of immunity during pregnancy. Placental sequestration of the parasite can contribute to this, can lead to maternal anaemia and to an increasing risk of death before and after childbirth. Conventional methods for malaria diagnosis are not suitable for field-based mass screening. Optical microscopy examination, the time-honored Gold Standard for malaria, requires an expert operator able to distinguish infected red blood cells (i-RBCs) in a blood smear using a good microscope. It is then an operator-dependent method, requiring about 60 minutes and a laboratory setting. Rapid Diagnostic Tests (RDTs) based on immuno-assay lateral-flow devices require just 15-30 minutes but are not quantitative and suffer from a large number of false negative-positive results, especially in endemic zones. Tests based on polymerase chain reaction (PCR) can detect extremely low parasite concentrations, but the field deployable version known as LAMP is not quantitative, has a high cost and long operation times (about 60 minutes), thus limiting its widespread use. To fill the gap between the current technology and the need for a cheap, fast and highly sensitive diagnostic tool suitable to mass screening in low-resource setting, the World Health Organization itself strongly recommends the development of novel RTDs with the same sensitivity of microscopy but with a reduced number of false positives and false negatives with respect to currently available lateral-flow devices. My thesis has contributed to develop an innovative system, named TMek, that provides a rapid and valid alternative to the actual devices and methods with a low cost and robustness suitable for its widespread use in the poorest endemic countries. TMek test is based on paramagnetic properties of malaria i-RBCs and Hemozoin Crystals (HCs) which allow their selective magnetophoretic separation, driven by an external magnetic field gradient. The infected blood corpuscles are concentrated at the surface of gold interdigitated electrodes thanks to magnetic concentrators placed in close proximity whereas healthy ones sediment because of gravity. Then, a change in resistivity, proportional to the amount of attracted particles (i-RBCs and HCs) is detected as an impedance variation by an electronic circuit. Following a lab-on-chip approach, the test is based on a silicon microchip, that has been fabricated in Polifab, composed by an array of micrometric nickel pillars allowing the magnetophoretic separation and planar interdigitated gold electrodes for the counting of the captured corpuscles. The blood sample to be analyzed is dispensed on a glass slide where a PDMS confinement gasket is prefabricated. In order to perform the experiments in the most reproducible and automated way possible, a mechanical setup has been designed: the chip and the glass slide with the gasket are placed in a cartridge, while a motorized linear stepper motor allows the external magnets to approach the back surface of the chip in a controlled way enabling magnetophoretic attraction. The measurement protocol is based on the magnets motion "downward" and "upward" in order to attract or release blood corpuscles. An electronic board, a portable power supply and a PC complete the setup configuration. The capability of TMek to perform the selective detection of i-RBCs and HCs has been investigated by multiphysics simulations and tested by means of capture experiments on bovine RBCs treated with NaNO2 to induce the full transformation of hemoglobin in methaemoglobin and mimicking the behavior of malaria infected ones, and on suspensions of synthetic HCs. The test has been carried out in different configurations: a horizontal configuration with the chip surface parallel to the floor and facing downwards and a vertical configuration, with the chip surface perpendicular to the floor. Thanks to the higher magnetic susceptibility of HC (4.1x10^−4) with respect to i-RBCs (1.8x10^−6) when the chip is operated in the horizontal configuration and the gravity force opposes the magnetic one, only HCs are detected. In the vertical configuration, instead, there is no threshold: the magnetic and gravity force are perpendicular and both HC and i-RBCs can be captured with concentrations down to, respectively, 10^5 HCs/µl and 10 i-RBCs/µl in 10 minutes. Preliminary tests on patients with malaria were successfully performed at the Sacco Hospital in Milano and the possibility to perform a follow up of the treatment has emerged. A study on parasite cultures at different stage of development (ring, trophozoite, gametocyte) has been done at Istituto Superiore di Sanità in Roma. The results suggest the possibility of discriminating the parasite stage by analyzing the waveform of the impedimetric signal in response to the application/removal of the external magnetic field. More recent tests, performed in July 2021, allowed us to get proper calibration curves on rings at 18 hours post RBC invasion and stage IV gametocytes, assessing the corresponding LODs. In addition, during this second validation campaign, the single infected cell and fingerprints of the infection stage have been identified. This is a disruptive feature of TMek system revealing that digital counting could be a powerful method for achieving high sensitivity and unequivocally select i-RBC with different parasite stages. Results on gametocytes and trophozoites detection are then presented. In April 2019, a pilot validation was carried out at Hôpital Saint Luc of Mbalmayo, in Cameroon on 75 suspected malaria patients. Using microscopy and RDT Bioline in parallel on the same samples, performances of TMek have been evaluated. Within the limits of this preliminary study, the lack of false negative results for TMek indicates a high sensitivity, 100% (93.3-100.0), both for venous and capillary samples meaning that the device did not miss any clinical malaria case. 9 false positive were found in venous samples, leading to a specificity of 69% (49.2-84.7) while no false positive results were detected from finger prick samples, at least within the limited number of these samples (just 10 due to time limitations in the first validation campaign). Even though the confidence intervals are very large, this preliminary study indicates the potential of TMek as quantitative, stage-selective, rapid diagnostic test for malaria. For the aforementioned project’s idea, two patents have been deposited. Moreover, TMek won the Polisocial award in 2017 and it was one of granted projects of Switch to Product context of Politecnico di Milano in 2018. In addition, during the 106th SIF National Congress, TMek received a special mention and it has been awarded through a publication on Il Nuovo Cimento [1].

Negli ultimi decenni, i test Point of Care (PoC) si sono progressivamente affermati come una delle tecnologie più promettenti nella lotta alla diffusione delle malattie infettive. Tuttavia, poiché la medicina è cieca senza un’accurata e veloce diagnosi, la ricerca in questo settore è ancora una questione aperta ed è sempre alla ricerca di nuove soluzioni. Di recente l'Organizzazione Mondiale della Sanità, anche sulla scia della pandemia di COVID-19, ha chiesto un'urgente collaborazione globale per sviluppare test in grado di ridurre la diffusione delle infezioni dovute ai principali agenti patogeni, tra cui il parassita della malaria, il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) , virus Dengue e Zika o Mycobacterium tuberculosis (TB). Allo scopo, questa tesi è focalizzata su TMek, un progetto sociale, ed in particolare sui suoi obiettivi principali e sui contributi originali raggiunti in ambito PoC test. Al giorno d'oggi, secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), la malaria è una delle malattie infettive potenzialmente letali più comuni ed una continua sfida alla salute pubblica globale. Nel 2019 sono stati registrati circa 229 milioni di casi con una stima di 409000 decessi in tutto il mondo. La maggior parte di questi, circa il 93%, si è verificata nell'Africa sub-sahariana dove la popolazione esposta al maggior rischio di morte è composta da bambini di età inferiore ai 5 anni, poiché in questo caso la malattia potrebbe facilmente evolvere verso una situazione di malaria grave, e in donne in gravidanza che non sono in grado di eliminare le infezioni a causa di una diminuzione fisiologica dell'immunità durante la gravidanza. Il sequestro placentare del parassita può contribuire a ciò, può portare all'anemia materna e ad un aumento del rischio di morte prima e dopo il parto. I metodi convenzionali per la diagnosi della malaria non sono adatti per lo screening di massa sul campo. L'esame al microscopio ottico, il Gold Standard per la malaria, richiede un operatore esperto in grado di distinguere i globuli rossi infetti (i-RBC) in uno striscio di sangue utilizzando un buon microscopio. È quindi un metodo user-dependent, che richiede un tempo operazionale di circa 60 minuti e strumentazione di laboratorio. I test diagnostici rapidi (RDT) richiedono solo 15-30 minuti ma non sono quantitativi e presentano un gran numero di falsi negativi e falsi positivi, specialmente nelle zone endemiche. I test basati su PCR possono rilevare concentrazioni di parassiti estremamente basse, ma la versione adatta ad un uso sul campo, nota come LAMP, non è quantitativa, ha un costo elevato e lunghi tempi di operazione (circa 60 minuti), limitandone così la diffusione. Per colmare il divario tra l'attuale tecnologia e la necessità di uno strumento diagnostico economico, veloce e altamente sensibile adatto allo screening di massa in un ambiente a basse risorse, la stessa Organizzazione Mondiale della Sanità raccomanda vivamente lo sviluppo di nuove RTD con la stessa sensibilità della microscopia ma con un numero ridotto di falsi positivi e falsi negativi rispetto ai dispositivi attualmente disponibili. La mia tesi ha contribuito a sviluppare un sistema innovativo, denominato TMek, che fornisce una rapida e valida alternativa agli attuali dispositivi, con un basso costo e adatto al suo uso diffuso nei paesi endemici più poveri. Il test TMek si basa sulle proprietà paramagnetiche dei globuli infetti dalla malaria e dei cristalli di emozoina (HC) che consentono la loro separazione magnetoforetica selettiva, guidata da un gradiente di campo magnetico esterno. I corpuscoli infetti si concentrano sulla superficie di elettrodi interdigitati d'oro grazie a concentratori magnetici posti nelle immediate vicinanze mentre quelli sani sedimentano per effetto della gravità. Quindi, una variazione di resistività, proporzionale alla quantità di particelle attratte (i-RBC e HC) viene rilevata come variazione di impedenza da un circuito elettronico. Seguendo un approccio lab-on-chip, il test si basa su un microchip di silicio, fabbricato a Polifab, composto da un array di cilindri micrometrici in nichel che consentono la separazione magnetoforetica e da elettrodi planari in oro interdigitati per il conteggio dei corpuscoli catturati. Il campione di sangue da analizzare viene dispensato su un vetrino in cui è prefabbricata un gasket in PDMS. Per eseguire gli esperimenti nel modo più riproducibile e automatizzato possibile, è stato progettato un setup meccanico: il chip e il vetrino con il gasket di contenimento sono inseriti in una cartuccia, mentre un motore consente ai magneti esterni di avvicinarsi al retro del chip in modo controllato consentendo l'attrazione magnetoforetica. Il protocollo di misurazione si basa sul movimento dei magneti "verso il basso" e "verso l'alto" per attirare o rilasciare i globuli attratti. Una scheda elettronica, un alimentatore portatile e un PC completano la configurazione del setup. La capacità di TMek di eseguire la rilevazione selettiva di i-RBC e HC è stata studiata mediante simulazioni multifisiche e testata mediante esperimenti di cattura su RBC bovini trattati con NaNO2, per indurre la completa trasformazione dell'emoglobina in metaemoglobina e mimare così il comportamento dei globuli infetti da malaria, e su sospensioni di cristalli di emoziona sintetica. Il test è stato eseguito in diverse configurazioni: una configurazione orizzontale con la superficie del chip parallela al pavimento e rivolta verso il basso e una configurazione verticale, con la superficie del chip perpendicolare al pavimento. Grazie alla maggiore suscettibilità magnetica di HC (4.1x10^−4) rispetto agli i-RBC (1.8x10^−6) quando il chip è in configurazione orizzontale e la forza di gravità si oppone a quella magnetica, vengono rilevati solo HC. Nella configurazione verticale, invece la forza magnetica e quella di gravità sono perpendicolari e sia HC che i-RBC possono essere catturati con concentrazioni rispettivamente fino a 10^5 HCs/µl e 10 i-RBC/µl in 10 minuti . Presso l'Ospedale Sacco di Milano sono stati eseguiti con successo test preliminari su pazienti affetti da malaria ed è emersa la possibilità di eseguire un follow up del trattamento. Presso l'Istituto Superiore di Sanità a Roma è stato condotto uno studio su colture di parassiti a diverso stadio di sviluppo (anelli, trofozoiti, gametociti). I risultati suggeriscono la possibilità di discriminare lo stadio del parassita analizzando la forma d'onda del segnale in risposta all'applicazione/rimozione del campo magnetico esterno. Test più recenti, eseguiti a luglio 2021, hanno permesso di ottenere curve di calibrazione su anelli a 18 ore dall'invasione dei globuli rossi e su gametociti allo stadio IV, valutandone i corrispondenti LOD. Inoltre, durante questa seconda campagna di validazione, la possibilità di detettare la singola cellula infetta e quindi l’impronta digitale dei vari stadi di infezione è stata dimostrata. Questa è una caratteristica dirompente per TMek in quanto suggerisce come il conteggio digitale possa essere un metodo potente nell’ottenere un'elevata sensibilità e nel selezionare inequivocabilmente i-RBC con diversi stadi del parassita. Risultati sulla rilevazione di gametociti e di trofozoiti sono dunque presentati. Nell'aprile 2019 è stata effettuata una validazione pilota presso l'Hôpital Saint Luc di Mbalmayo, in Camerun, su 75 pazienti sospetti di malaria. Utilizzando microscopia e RDT Bioline in parallelo sugli stessi campioni, sono state valutate le prestazioni di TMek. Nei limiti di questo studio, la mancanza di falsi negativi indica che TMek ha un'elevata sensibilità, 100% (93,3-100,0), sia per campioni venosi che capillari, il che significa che il dispositivo non manca alcun caso clinico di malaria. 9 falsi positivi sono stati trovati in campioni venosi, portando a una specificità del 69% (49,2-84,7) mentre nessun falso positivo è stato rilevato in campioni ottenuti da puntura del dito (solo 10 campioni a causa del limitato tempo). Anche se gli intervalli di confidenza sono molto ampi, questo studio preliminare indica il potenziale di TMek come test diagnostico rapido quantitativo e selettivo per la malaria. Per la suddetta idea sono stati depositati due brevetti. Inoltre, TMek ha vinto il premio Polisocial nel 2017 ed è stato uno dei progetti premiati del contesto Switch to Product del Politecnico di Milano nel 2018. Inoltre, durante il 106° Congresso Nazionale SIF, TMek ha ricevuto una menzione speciale ed è stato premiato attraverso un pubblicazione su Il Nuovo Cimento [1].