Synthesis of biologically active molecules by continuous flow biocatalysis

Biocatalysis is a deeply investigated field, whose importance lies in the broad range of highly stereo- and enantioselective reactions under low environmental impact conditions it offers to organic chemists. Still, some issues like low productivity and low long-term stability of the biocatalysts can sometimes hinder larger-scale industrial applications. Enzyme immobilization is a widely exploited tool to overcome some of such limitations by increasing biocatalyst durability and affording its reusability. Moreover, the immobilization favors enzyme exploitation in small-sized reactors, working under continuous-flow conditions, according to the “flow chemistry” approach. Integration between enzyme-catalyzed reactions and in-line work-up or among other enzymatic or synthetic steps is considered one of the main advantages ascribed to flow biocatalysis, along with significantly easier scalability. Starting from conventional, aqueous-based enzymatic reactions, the main goal of this project was the development of continuous-flow enzymatic-mediated reactions for the preparation of compounds of industrial interest such as flavors, fragrances or pharmaceutical intermediates. The work has been carried out in collaboration with the Dipartimento di Scienze del Farmaco, of the University of Pavia (Pavia, Italy) and with the Istituto di Chimica del Riconoscimento Molecolare, of the C. N. R. (Milano, Italy). To better represent the technological upgrade involving biocatalysis, this work is divided into three parts: first, “traditional” biocatalysis was addressed; then, enzyme immobilization was concerned and finally continuous-flow enzymatic and chemo-enzymatic reactions were approached as possible final development for enzymatic mediated processes. In the first part, enzymatic reduction of aliphatic and aromatic α-nitroketones to β-nitroalcohols using commercial alcohol dehydrogenases (ADHs) is described. High conversions and enantioselectivity values could be achieved with two specific ADHs, affording either the (S) or the (R)-enantiomer of the corresponding nitroalcohols. In the second part, immobilization of OYE3, an ene-reductase particularly active for stereoselective reduction of activated C=C bonds, was investigated. Glyoxyl agarose (for covalent immobilization) and EziGTM Opal (a commercial Fe3+ glass support for metal coordination) were selected as suitable carriers. After some experiments for testing immobilized derivatives stability and reusability, the former appeared superior to the latter in terms of reusability, suggesting that glyoxyl agarose could be a more suitable support for OYE3 immobilization. The last part concerns the application of flow conditions to enzymatic and chemo-enzymatic reactions. Moving from immobilization to implementation of continuous-flow biocatalytic reactions, the first process studied in this work was the continuous-flow preparation of two commercial fragrances, leather cyclohexanol and woody acetate that are sold as mixture of cis- and trans-isomers. The two compounds were prepared with high diastereoisomeric excess (de>90%) to the cis-isomer (more valuable for its olfactory characteristics but less thermodynamically favored) by ADHs-reduction, followed by lipase-mediated acetylation for woody acetate synthesis. The implementation of the two processes under continuous-flow conditions was made possible by using a membrane reactor (CSTR) for ADH-mediated reduction and a column reactor (PFR) for lipase-mediated acetylation, coupled with in-line extraction and work-up. The last two studied processes were based on lipase-mediated in situ formation of peroxycarboxylic acids for alkene epoxidation. In both cases, epoxidation was meant as the first step of C=C oxidative cleavage, as an alternative chemo-enzymatic route to ozonolysis or chromic acid oxidation. In one example, perhydrolysis of ethyl acetate was exploited for peroxyacetic acid formation to obtain epoxidation of isosafrole, followed by chemical epoxide opening to the diol and its MnO2-based oxidative cleavage to piperonal. In the other work, lipase promoted oleic acid self-epoxidation in presence of H2O2 for diol oleic acid preparation, followed by oxidation with NaClO to azelaic and pelargonic acid. Continuously-stirred tank reactor was chosen as best reactor configuration for enzymatic epoxidation, while for the second synthetic step a plug-flow configuration was developed. The introduction of biocatalyzed continuous-flow reactions offers the benefits of increasing the automation degree of the process, with a gain in productivity and yields. Beyond that, when coupled with enzyme immobilization, stability and reusability of the biocatalyst can be an additional benefit. For these reasons, flow biocatalysis with immobilized enzymes is becoming a well-established practice receiving an ever-increasing interest from academia and industry. In summary, this work contributed to expand the range of the possible applications of continuous-flow biocatalysis, as a further proof of the advantages of its exploitation, demonstrating its efficiency for the enzymatic and chemo-enzymatic reactions involved.

La biocatalisi è un campo scientifico di grande interesse la cui importanza risiede soprattutto nell’offerta di un’ampia gamma di reazioni altamente selettive e a basso impatto ambientale, utilizzabili nell’ambito della chimica organica. Tuttavia, l’applicazione su scala industriale di reazioni biocatalitiche è spesso limitata da una bassa produttività e dalla ridotta stabilità a lungo termine dei catalizzatori. Tali limitazioni possono essere parzialmente superate dall’immobilizzazione degli enzimi coinvolti, aumentandone la stabilità e favorendone il riutilizzo per più reazioni consecutive. Un altro aspetto vantaggioso è la possibilità di utilizzare enzimi immobilizzati all’interno di reattori miniaturizzati operanti in condizioni di flusso continuo, secondo l’approccio della “chimica in flusso”. I principali vantaggi attribuiti a tale approccio sono la possibilità di combinare più reazioni (enzimatiche o sintetiche) e di abbinarle ai rispettivi passaggi di work-up senza dover intervenire nell’isolamento dell’intermedio e a una più semplice scalabilità del processo. Partendo da reazioni enzimatiche convenzionalmente condotte in acqua, questo lavoro di tesi ha come obiettivo lo sviluppo di reazioni enzimatiche in condizioni di flusso continuo per la preparazione di composti di interesse industriale come aromi, fragranze e intermedi farmaceutici. Il lavoro è stato condotto in collaborazione con il Dipartimento di Scienze del Farmaco dell’Università di Pavia e con l’Istituto di Chimica del Riconoscimento Molecolare del C.N.R. di Milano. Seguendo il percorso di incremento tecnologico che ha coinvolto la biocatalisi, gli argomenti trattati all’interno della tesi sono suddivisibili in tre gruppi principali: la prima parte del lavoro riguarda la biocatalisi “convenzionale” che utilizza soluzioni acquose ed enzimi in soluzione, nella seconda parte viene trattata l’immobilizzazione di un enzima mentre nella terza viene presentato lo sviluppo di reazioni enzimatiche e chemo-enzimatiche in condizioni di flusso continuo come possibile punto d’arrivo nello sviluppo di processi enzimatici. Nella prima parte è descritta la riduzione enzimatica di α-nitrochetoni, sia alifatici che aromatici, ai corrispondenti β-nitroalcoli utilizzando alcol deidrogenasi (ADH) commerciali. Alti valori di conversione ed enantioselettività sono stati ottenuti con due degli enzimi utilizzati, attraverso i quali sono stati isolati entrambi gli enantiomeri (S) ed (R) di tutti i nitroalcoli analizzati. Nella seconda parte, l’immobilizzazione di OYE3, una ene-reduttasi particolarmente attiva nella riduzione stereoselettiva di doppi legami C=C attivati, viene descritta per la prima volta. Il gliossil-agarosio e il supporto commerciale EziGTM Opal contenete ione Fe3+ sono stati selezionati come possibili supporti per, rispettivamente, l’immobilizzazione di tipo covalente e per coordinazione a metalli di transizione. Dati diversi esperimenti volti a testare la stabilità e il potenziale riutilizzo dei derivati immobilizzati, il gliossil-agarosio mostra una più alta efficacia in termini di riusabilità del derivato. Per quanto riguarda i processi enzimatici o chemo-enzimatici in flusso continuo, il primo lavoro qui presentato tratta della preparazione in continuo di due fragranze commerciali, il “leather cyclohexanol” e il “woody acetate”, vendute come miscele di isomeri cis- e trans-. Utilizzando delle alcol deidrogenasi commerciali, i due composti sono stati preparati per riduzione selettiva dei corrispondenti chetoni, favorendo l’isomero cis- (cui corrispondono migliori caratteristiche olfattive, ma che è più difficile da ottenere dell’isomero trans- per ragioni termodinamiche) con un elevato eccesso diasteromerico (de>90%). La sintesi enzimatica del woody acetate è stata completata acetilando l’alcol ottenuto in precedenza per mezzo di una lipasi. L’implementazione dei due processi in condizioni di flusso continuo è stata resa possibile dall’utilizzo di un reattore a membrana (CSTR) per la riduzione con le alcol deidrogenasi e da un reattore a colonna (PFR) per l’acetilazione con lipasi, combinati tra loro da un’estrazione con solvente e separazione delle due fasi liquide in continuo. Gli altri due processi studiati riguardano l’epossidazione di alcheni mediata da acidi percarbossilici preparati in situ utilizzando delle lipasi come catalizzatori. In entrambi i casi, l’epossidazione rappresenta il primo passaggio della scissione ossidativa del doppio legame C=C, come possibile alternativa chemo-enzimatica all’ozonolisi o all’ossidazione con acido cromico. Nel primo esempio, la peridrolisi di acetato di etile è stata utilizzata per la formazione di acido peracetico per l’epossidazione dell’isosafrolo, seguito dall’apertura chimica dell’epossido a diolo e dalla scissione ossidativa dello stesso a piperonale utilizzando MnO2 come ossidante. Nel secondo lavoro, la lipasi promuove l’auto-epossidazione dell’acido oleico in presenza di H2O2 per la preparazione del diolo dell’acido oleico, seguito dall’ossidazione con NaClO ad acido azelaico e acido pelargonico. Un reattore continuo di tipo CSTR è stato scelto come migliore configurazione per l’epossidazione enzimatica, mentre per il secondo stadio sintetico il reattore utilizzato è di tipo PFR. L’introduzione di reazioni biocatalitiche in flusso continuo offre i benefici di aumentare il grado di automazione del processo, con conseguente aumento di produttività e rese. Oltre a ciò, quando accoppiato con l’immobilizzazione enzimatica, la stabilità e la riusabilità del biocatalizzatore possono essere ulteriori vantaggi. Per queste ragioni, la biocatalisi in flusso continuo con enzimi immobilizzati sta diventando una pratica consolidata, ricevendo un interesse sempre crescente sia dal mondo accademico che da quello industriale. Questo lavoro cerca perciò di contribuire ad espandere la gamma di possibili applicazioni di reazioni biocatalitiche in flusso continuo, come ulteriore prova dei vantaggi del suo utilizzo, dimostrandone l’efficacia quando reazioni enzimatiche e chemo-enzimatiche sono coinvolte.