3D-BBB-on-chip, development of a microfluidic device to mimic the human BBB to study the early steps of breast cancer metastasis formation

The interaction of cancer cells with the blood-brain-barrier (BBB) is the early and crucial step of brain metastasis formation, a poorly studied and understood step due to the BBB critical location and complexity. Despite the contribution of animal models to cell-cell interaction studies, a human 3D in vitro BBB-model was needed. Here, we fabricated and developed a microfluidic 3D-chip featuring an in vivo–like cylindrical geometry resembling a brain blood vessel. The 3D-chip design included two lateral channels separated by pillars from the central one. The device was fabricated in PDMS using photo- and soft- lithography. The novel design allowed to accommodate a cylindrical vascular-like lumen, formed by a needle (140µm Ø) casted in a biocompatible 3D-gel matrix which allows cells embedding. Different biocompatible 3D-gel matrixes were tested, to ensure a structural stiffness to support the lumen as well as brain cells embedding, finding a collagen and fibrin gel mix as final solution. We then set up the lumen cell seeding and growth using HUVECs, by titrating the lumen ECM-coating, the cell concentration, the seeding method and the flow system. With this set-up HUVECs formed a tight cylindrical monolayer within 72h, expressing typical endothelial adherens-junction (VE-cadherin, CD31-PECAM1) and tight junction (ZO-1), with a low permeability (4 and 40 kDa Dextran). These numerous set-ups were then applied to brain hCMEC/D3, which formed a tight cylindrical monolayer between 72-120h, expressing VE-cadherin and ZO-1, with a low permeability. Finally, we incorporated, to the endothelial lumen, human pericytes (PCs) derived from the neural crest, titrating the cells seeding concentration either in the lumen or in the 3D-gel matrix. We observed that the co-culture of PCs in the lumen led the pericytes to migrate in the 3D-gel, damaging the endothelium, while PCs embedded in the 3D-gel at a concentration of 30x105 cells/ml filled homogenously the 3D-matrix wrapping the endothelium. In conclusion, we designed a microfluidic 3D-chip to accommodate a 3D-human-BBB forming a cylindrical endothelial barrier to study cancer-endothelial cells interaction.

L’interazione tra cellule tumorali e barriera ematoencefalica (BEE) rappresenta il primo critico step nella formazione di metastasi cerebrali, evento poco conosciuto e studiato a causa della critica posizione e complessità della BEE. Nonostante il contributo dato dai modelli animali nello studio delle interazioni tra cellule, un modello in vitro umano 3D di BEE era necessario. In questo lavoro è stato sviluppato e fabbricato un chip microfluidico 3D in grado di ricreare una geometria cilindrica che mima le caratteristiche del capillare cerebrale. Il design comprende due canali laterali separati da quello centrale da ‘pillars’. Il chip è realizzato in PDMS attraverso le tecniche della foto- e soft-litografia. Il nuovo design permette di ottenere un lume cilindrico, generato da un ago (140µm Ø) che lascia la sua `impronta` in una matrice di gel 3D, la quale può contenere cellule. Una matrice di collagene e fibrina è stata scelta come più adeguata sia nella rigidezza per supportare il lume che per la coltivazione di cellule. Le procedure di semina e crescita sono state valutate, utilizzando le HUVEC, testando il coating del lume, la concertazione cellulare, il metodo di semina e la realizzazione di un sistema per il flusso. Le HUVEC formano un monolayer cilindrico in 72h, esprimendo le giunzioni endoteliali aderenti (VE-cadherin, CD31-PECAM1) e occludenti (ZO-1) e una bassa permeabilità (al Dextran 4 e 40 kDa). Infine, questi set-up sono stati applicati alle hCMEC/D3, formando un monolayer cilindrico in 72-120h. Esprimendo le giunzioni cellulari VE-CAD e ZO-1 e mostrando una bassa permeabilità. Infine, è stata testata, la co-coltura con periciti umani, prelevati dalla cresta neurale, sia nel lume che nella matrice. Abbiamo osservato che la co-coltura nel lume causava la migrazione dei periciti nel gel, danneggiando l’endotelio. Mentre seminando i periciti direttamente nel gel (30x105 cellule/ml) questi lo riempivano omogeneamente e avvolgevano l’endotelio. In conclusione, abbiamo progettato un chip microfluidico in grado di ricreare un modello umano 3D di BEE con forma cilindrica per studiare l'interazione tra cellule tumorali ed endoteliali.