Development of a bioseparation strategy for large scale production of extracellular vesicles

Extracellular vesicles represent an advanced system of intercellular communication, able to mediate physiological and pathological processes in living organisms. In the last decades, they attracted increasing interest in the biotechnology field thanks to their remarkable properties, with potential applications in medicine, cosmetics and nutrition. However, the current techniques for their production and purification suffer from severe limitations, which hinder their large scale manufacturing and the realization of EVs-based products. Here an innovative bio-inspired method is proposed to address the current issues, inspired by the recent observations on cellular compartmentalization. Specifically, we propose smart polymers with tailored features, mimicking the cellular condensates by liquid-liquid phase separation (LLPS), as a prominent alternative for bioseparation of soft biological products. In this work we apply the controllable LLPS of smart polymers to generate a separation technique capable to adsorb and release target components based on their charge and in response to change in ionic strength, in analogy to ion-exchange chromatography. The polymers employed were synthesized via RAFT polymerization, and their LLPS behaviour was characterized in terms of stimulus responsiveness to changes in ionic strength. We then applied these polymers to recruit and release biomolecules of increasing complexity, including BSA, liposomes and EVs. The purification strategy was successful and allowed to preserve the integrity of the isolated biomolecules. Lastly, in the perspective of the application of this material in combination with ultrafiltration via membranes, the polymers' architecture was optimized to minimize adsorption on surfaces, while maintaining their isolation performances.

Le vescicole extracellulari rappresentano un avanzato sistema di comunicazione inter-cellulare, capaci di mediare svariati processi fisiologici e patologici negli organismi viventi. Negli ultimi anni, le vescicole hanno suscitato un crescente interesse nel campo delle biotecnologie, grazie alle loro rilevanti proprietà e alle loro potenziali applicazioni negli ambiti della medicina, della cosmetica e della nutrizione. Tuttavia, le tecniche per la produzione e purificazione delle vescicole attualmente adottate, sono soggette a severe limitazioni che ostacolano la loro produzione su larga scala e la realizzazione di prodotti basati su di esse. Per questo motivo, in questa tesi si è puntato a proporre un metodo di purificazione innovativo, ispirato dalle recenti osservazioni in merito alla compartimentalizzazioene cellulare, atto a superare le attuali problematiche riscontrate. In particolare, la promettente alternativa per la separazione di prodotti biologici, è rappresentata dai polimeri "smart", dotati di specifiche caratteristiche in grado di conferire la capacità di simulare la seprazione di fase liquido-liquido dei condensati cellulari. In questo lavoro, è stata sfruttata la separazione liquido-liquido dei polimeri "smart", per ottenere una tecnica di separazione capace di adsorbire e rilasciare le biomolecole target. Questo è realizzato basandosi sulla affinità di carica in risposta a cambiamenti della forza ionica della soluzione, in analogia alla cromatografia a scambio ionico. I polimeri utilizzati sono stati sintetizzati mediante una reazione di polimerizzazione RAFT. Inoltre, il comportamento dei polimeri separati di fase è stato caratterizzato in termini di risposta agli stimoli causati da variazioni della concentrazione di sale in soluzione. Successivamente, i polimeri sono stati impiegati come mezzo di bioseparazione per la cattura e il successivo rilascio di biomolecole di crescente complessità, specificatamente BSA, liposomi e vescicole extracellulari. La strategia proposta si è dimostrata efficace e capace di mantenere inalterate le biomolecole isolate. Infine, la struttura molecolare dei polimeri è stata ottimizzata, in prospettiva di una applicazione del processo in combinazione con ultrafiltrazione attraverso membrane. Tale studio è stato condotto per dotare i polimeri di proprietà sia fisiche che interfacciali necessarie ad impedire l'adsorbimento di questi sulle superfici durante la purificazione delle biomolecole.